LAMP技术及应用
LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例.LAMP引物的设计LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。
2.扩增原理60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65℃左右处于动态平衡状态。
因此,DNA在此温度下合成是可能的。
利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。
使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。
上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合(如图B所示),在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。
外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链(如图C所示)。
FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。
自我碱基配对形成环状结构(如图C所示)。
以此链为模板。
下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成,形成哑铃状结构的单链。
迅速以3' 末端的Fl区段为起点。
以自身为模板,进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
LAMP技术及应用 PPT

LAMP法在结核菌检测中的应用
技术特点:
适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象,可避免假阳性过高。
反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行,有效降低气溶胶 污染;用户操作简便、减少操作误差。
结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
LAMP法在结核菌检测中的应用
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法和其他PCR法的比较
技术特点
特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段,特异性高于PCR和qPCR
灵敏度高 扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。
检测时间短 恒温扩增,省却温度循环,扩增时间60min。
设备简易,可同时检测多批样本 不需特定或高端检测仪器,恒温设备即可,例如水浴锅, 可以随时放入后续批次样本。
琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知,LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物,即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此,LAMP扩增产物在2%的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。(图A)
肉眼观察法 在LAMP反应过程中,可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。(图B)
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群,包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本, 长远来说,更有利于避免耐药性的产生。
gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因,在复合群进 化过程中非常保守,LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
通过荧光染料检测 有时,通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差,所
LAMP

LAMP(环介导等温扩增)技术2011-07-28 11:46 来源:北京蓝谱点击次数:1341 关键词:LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到:收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用,其灵敏度高、特异性好,是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂,对仪器和人员要求比较高,不适合基层或现场快速诊断,因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术,即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”,受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注,短短几年,该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中,在这次甲型H1N1流感事件中,日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广,LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中,并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外,操作十分简单,对仪器设备要求低,一台水浴锅或恒温箱就能实现反应,结果的检测也很简单,不需要像PCR那样进行凝胶电泳,LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断,简便快捷,适合基层快速诊断。
可以预见,在未来的基因诊断领域,LAMP方法将占据大壁江山。
目前,在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见:/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍:LAMP方法优点:灵敏度高(比传统的PCR方法高2~5个数量级);反应时间短(30~60min就能完成反应);临床使用不需要特殊的仪器(试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪);操作简单(不论是DNA还是RNA,检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中,置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30~60min,肉眼观察结果)。
LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用

LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术是一种能够在恒温下快速、高效地进行核酸扩增的方法。
它通过特殊的引物和酶,在简单的实验条件下可以在短时间内扩增大量目标DNA序列,并且具有高度的特异性和灵敏性。
LAMP技术最早由日本学者Notomi等人于2000年首次提出,自此以后,LAMP技术在许多领域得到了广泛的应用,尤其在动物疫病检测中。
1.快速诊断:LAMP技术可以在一个小时内进行核酸扩增反应,比传统的PCR方法要快得多。
这对于迅速确定疫病的诊断结果非常重要,可以提高动物疫病的早期预警和防控能力。
2.高度特异性:LAMP技术使用多个特异性引物,在同一个反应体系中进行扩增,可以显著提高对目标序列的特异性识别能力。
这对于区分不同疫病病原体或者同一病原体的不同亚型具有重要意义,可以帮助鉴定传染病源和病原菌的变异。
3.高灵敏性:LAMP技术不仅在快速扩增速度上具有优势,还在扩增效果上具有高灵敏性。
在初始目标DNA浓度低至10个分子时,LAMP技术仍能够进行有效扩增,这对于低浓度病原体的检测非常关键。
4.操作简便性:LAMP技术不需要复杂的设备和特殊的实验条件,只需要一个简单的恒温器就可以进行核酸扩增反应。
这极大地降低了操作门槛,使得不同实验室和场所都可以进行动物疫病的检测工作。
5.物价低廉:LAMP技术所需的试剂和设备成本相对较低,特别是与PCR技术相比较,更加经济实惠。
这对于资源有限的地区和农村地区的疫病监测和防控工作尤为适用。
目前,LAMP技术已经在许多动物疫病的检测中得到了应用。
比如,它被成功用于禽流感、猪瘟、传染性胸膜炎、家禽新城疫等重大疫病的快速检测。
通过该技术,可以快速而准确地检测出病原体的存在,为疫病的早期检测和防控提供了有力的手段。
总之,LAMP技术在动物疫病检测中具有广阔的应用前景。
随着该技术的不断进步和完善,相信将能够更好地满足动物疫病检测的需求,为动物疫病的防控提供更加可靠、快速和经济实惠的手段。
lamp技术原理和引物设计

lamp技术原理和引物设计LAMP原理及引物设计与实例(LAMP引物的设计LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。
2(扩增原理60-65?是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65?左右处于动态平衡状态。
因此,DNA在此温度下合成是可能的。
利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。
使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。
上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合(如图B所示),在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。
外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链(如图C所示)。
FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。
自我碱基配对形成环状结构(如图C所示)。
以此链为模板。
下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成,形成哑铃状结构的单链。
迅速以3' 末端的Fl区段为起点。
以自身为模板,进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
LAMP,bDNA,NASBA技术原理与应用比较——北京蓝谱

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常用反应体系
FIP,BIP: F3,B3: loopF,B: dNTP: Betaine: Tween20: (NH4)2SO4: MgSO4: KcL: Tris-Hcl(pH8.8): Bst : 40pmol 5pmol 20pmol 1.4mM 0.8M 0.1% 10mM 8mM 10mM 20mM 8U
◎ amplification △ additional step △ additional step △ additional step △ additional step ~ ◎ 15~ 60 min. △ ◎ 2~3 hrs △ △ 2~3 hrs △ △ 1~2 hrs △ △ 2~3 hrs △
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二、NASBA技术原理与应用
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NASBA检测应用
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NASBA检测技术特征
使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环 反应. 上游引物带有T7RNA聚合酶结合位点,下游引 物带有ECL检测核苷酸序列,此外,还有一条 俘获探针用于固定扩增产物. 扩增产物是单链RNA,后续操作较复杂. 连续等温反应,特殊仪器进行检测, 特异性强,灵 敏度高,但成本也非常高昂. 可与分子信标探针联合使用,进行单管实时荧光 检测.
有无扩增反应可在UV灯下观 有无扩增反应可在 灯下观 测颜色的变化 有无扩增反应可借助肉眼判断扩 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 定
不需要特殊的试剂或仪器
-
+
- 模板:PSA 模板
+
模板: 模板 PSA 荧光剂: 荧光剂 Ethidium Bromide (0.5 ug/ml)
LAMP技术及其在微生物检测中的应用

1 L AM P技 术 简 介 11 L . AMP技 术 原 理
L MP法 是 由 N t 等 … A oo mi 1于 2 0 0 0年 开 发 出 来 的 一 种
同 样 认 为 L MP技 术 特 异 性 和 灵 敏 性 高 。 国 内刘 全 英 等¨】 A
采 用 L P技 术 扩 增 了 大 肠 杆 菌 O1 7特 异 性 基 因 , 与 M A 5 并
《 海 畜牧兽 医通 讯》 2 1 上 0 0年 第 5期
・ 1・ 6
L AMP技 术 及其 在 微 生物 检 测 中 的应 用
鞠 慧 萍 宋 白薇 石 建 华 葛 睛 颖
(苏 州 出入境 检验 检疫 局 江 苏 苏 州 2 5 0 ) 1 14
近年 来 , 着 食 品 安 全 事 件 的 频 繁 发 生 , 品安 全 问题 随 食
1 2 I M P 技 术 的 优 缺 点 . A
12 1 优 点 :1 特 异 性 强 、 敏 度 高 。4条 引 物 可 以 严 格 识 .. () 灵 别 靶 核 酸 序 列 上 的 6个 独 立 区 域 , 应 过 程 不 会 受 到 反应 混 反 合 物 种 非 靶 序列 D A 的 影 响 , 证 了 L MP扩 增 的 高度 特 N 保 A
LAMP技术及应用

LMP技术与其他技术的结合应用
LMP技术与云 计算的结合: 提高数据处理 能力降低成本
LMP技术与大 数据技术的结 合:提高数据 分析能力挖掘
数据价值
LMP技术与人 工智能技术的 结合:提高智 能化水平实现
自动化运维
LMP技术与物 联网技术的结 合:实现设备 互联提高数据 采集和处理能
力
感谢观看
反应体系:接着需要准备反应体 系包括模板DN、引物、DN聚合 酶、dNTPs等。
反应过程:最后进行反应过程包 括变性、退火、延伸等步骤最终 得到扩增的DN片段。
输出:扩增的DN片段可以通过电 泳、荧光定量PCR等方法进行检 测和定量。
LMP技术的优点
开源:LMP技术是开源的用户可 以自由使用和修改
LMP技术的组成
Linux操作系统:提供稳定的运 行环境
pche Web服务器:提供网页 服务
MySQL数据库:存储和管理数 据
PHP编程语言:实现动态网页 和后端逻辑
LMP技术的应用场景
网站开发:LMP技术广泛应用于网站开发包括企业网站、电子商务网 站、社区论坛等。
应用程序开发:LMP技术可以用于开发各种应用程序如ERP、CRM、 O等。
LMP技术的新研究方向
云计算:LMP技术在云计算中的应用和优化 大数据:LMP技术在大数据存储和处理中的应用 物联网:LMP技术在物联网设备管理和数据分析中的应用 人工智能:LMP技术在人工智能算法和模型训练中的应用
LMP技术在未来的应用前景
云计算:LMP技术在云计算中的应用将更加广泛为云计算提供强大的支持。 大数据:LMP技术在大数据中的应用将更加深入为处理和分析大数据提供强大的支持。 物联网:LMP技术在物联网中的应用将更加广泛为物联网提供强大的支持。 人工智能:LMP技术在人工智能中的应用将更加深入为开发更加智能的应用提供强大的支持。
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LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数,扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环,在30min~60min内即可完成反应 过程。
三、结果判断
2、在阴性对照反应管液体颜色为无色(或橙色),阳性对照反应管 液体颜色呈绿色的条件下:
• 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色,则可报告该样本检测结果 为结核分枝杆菌阳性;
• 若待检样本反应管中液体颜色为无色(或橙色),则可报告该样 本检测结果为结核分枝杆菌阴性;
• 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符,则本次检测结果无效, 应重新检测。
LAMP技术及应用
湖北省疾控中心结防所 周丽平
2020年3月1日星期日
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时,其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年3月1日星期日
LAMP法的引物设计
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年3月1日星期日
痰标本目测法检测流程
100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min,尽量吸弃上清
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂(BD快速培养)对比结果
➢ 灵敏度=89.54% ➢ 特异性=98.93% ➢ 总符合率=95.31%
阳性结果预期值=98.13% 阴性结果预期值=93.77%
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中,可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。(图B)
➢ 通过荧光染料检测 有时,通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差,所
以也可通过添加荧光染料,如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色,来检测扩增是否发生。(图C)
(5)随访患者 LAMP结果阳性,不能作为随访患者的疗效评价。
一点建议
•根据试剂盒不同、实验室严格分区 –溶液配制区、样品处理区、检测区
•基本操作 –混匀、吸取 –模板最后加入,按照先阴性、后阳性, 从低到高梯度,最后阳性对照
•环境污染 –UV照射 –DNAZAP等DNA降解试剂
2020年3月1日星期日
(3)LAMP结果为阴性,涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标 本中的抑制物影响,并增加一个或一个以上的标本检测。若增加的标 本检测结果仍不变,且排除抑制物因素,则患者可初步考虑为非结核 分枝杆菌感染,进行进一步确诊实验。
(4)LAMP结果为阴性,涂片结果亦为阴性。根据临床症状判断是否开 始抗结核治疗,并等待培养结果。
2020年3月1日星期日
LAMP法常规操作步骤
2020年3月1日星期日
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知,LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物,即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此,LAMP扩增产物在2%的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。(图A)
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀,从而能定性 判断LAMP反应;可与荧光物质结合。
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法所需的试剂
2020年3月1日星期日
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因,在复合群进 化过程中非常保守,LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群,包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
实验室基础设施、设备的要求较少,逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日,在日内瓦发布了一份 最新的推荐书,推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法,可以作为痰涂片检测方法的替代方案
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
2020年3月1日星期日
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下(约 65℃)进行核酸扩增反应,克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点,从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增,并且可以通过简易直观的目测判读结果,相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂(TB-qPCR)对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020年3月1日星期日
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比,TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法,如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查,TB-LAMP法检出率要高40%。
二、核酸扩增
1、向反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳 性对照各2.5μL,注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反
应管大腔内,盖紧管盖并做好标记,移至反应区
二、核酸扩增 2、置65℃恒温反应60min
三、结果判断
1、反应结束,将反应管倒置甩动2次,再正置甩动2次, 使工作液与显色液充分混合
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本, 长远来说,更有利于避免耐药性的产生。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点:
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象,可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行,有效降低气溶胶 污染;用户操作简便、减少操作误差。
谢谢!
2020年3月1日星期日
LAMP检测结果的临床应用
(1)LAMP结果为阳性,涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核 病的诊断,并开始抗结核治疗,同时等待培养结果。
(2)LAMP结果阳性,而涂片结果为阴性。根据临床症状判断是否开始 抗结核治疗,同时等待培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上的 标本进行LAMP检测以确认。如果增加的标本检测结果也为阳性,则患 者可被初步诊断为患有结核病,并等待培养的结果。
一、样品处理 3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤
一、样品处理
4、13000r/min离心10min,尽量吸弃上清 5、重复步骤3、4一次
一、样品处理
6、向含沉淀物的离心管分别加入100μL DNA提取液,混 匀后沸水浴10min
一、样品处理
7、冷却至室温后, 13000 r/min离心﹥5min,上清 即为核酸模板
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
ห้องสมุดไป่ตู้
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物,利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
成,从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。