蛋白质晶体的生长冻存及装载
关于蛋白质的单晶培养方法
生物样品储存方法概述-冷冻保存
生物样品储存方法概述-冷冻保存将需要冷冻的样品冷冻（freezing,放于-20?C或-80?C）得当能有效的保证样品质量！下面给大家安利几种常见样品的冷冻储存方式：DNA及缓冲液：对于基因组材料来说，收到轻微的机械剪切力不是什么大事情；对于不稳定的缓冲液，如含有DTT的缓冲液，可直接冷冻储存，无需调整。
蛋白：需要添加防冻剂用于蛋白的冷冻储存。
蔗糖或甘油是防冻剂很好的选择，但对于不同的蛋白，蔗糖或甘油所占的百分比须有所不同。
可选择20％的蔗糖或10％的甘油。
限制性内切酶可以储存在50％甘油中以保持稳定性。
由于较低的冷冻温度，这种甘油的浓度可防止溶液完全冻结！微生物（细菌，酵母和真菌）：10-20％甘油效果很好。
更高的百分比（即更接近20％）使平板划线更加容易。
高等真核细胞：常见的的冷冻过程为（仅供参考）：1. 配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
8．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；9．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；10．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
蛋白储存buffer条件
蛋白储存buffer条件
1. 低温储存：蛋白应该以冷冻或低温的方式储存，通常在-
20°C或更低的温度下。
低温可以防止蛋白质降解、失活或产
生聚集。
2. pH适宜：选择适当的缓冲液来调节蛋白的pH值。
pH过高
或过低都可能导致蛋白质失活或聚集，因此应选择pH稳定的
缓冲液。
3. 高盐浓度：加入适当浓度的盐可以增加蛋白在储存过程中的稳定性，减少蛋白质聚集或失活的风险。
4. 防止冻融循环：频繁冻融会导致蛋白质的失活和降解。
因此，应该避免反复的冻结和解冻，一次性分装成适量的小份，以减少冻融次数。
5. 避光：蛋白质容易受到光照的影响而降解，所以应该避免阳光直射或强光照射。
6. 无菌条件：储存容器和使用过程中应保持无菌，以防止细菌或其他微生物的污染。
7. 添加保护剂：可以在蛋白储存buffer中添加一些保护剂，如甘油、蔗糖、D-己糖等，以增加蛋白质的稳定性和储存寿命。
尽管以上条件是通用的蛋白储存buffer条件，但具体的储存条件仍需根据具体蛋白质的特性和研究要求来确定。
蛋白结晶技术精品课件
主要参考书目
• 卢光莹.《生物大分子晶体学基础 第二版》. 北京大学出版社.
• 梁栋材. 《X射线晶体学基础 第二版》.科学 出版社.
• Barry s. selinsky. <membrane protein protocols>.Human Press.
联系方式
邮箱 kuni071@163. com
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• Additive Screen™ HR2-428
利用样品间和样品溶剂间相互
作用来优化晶体生长和改变样品溶解度
膜蛋白结晶技术
• 膜蛋白可根据膜上的位置和分离的难易分 为周边和本体两类。
• 膜蛋白有疏水和亲水两个部分，其非极性 区域倾向于形成无序化聚合物，需要采用 特殊的条件才能使膜蛋白形成晶体。
Background
• 蛋白质的功能是基于蛋白质的三维结构，应用Xray蛋白质的结构需要得到高质量的蛋白质晶体。
• 得到高质量的蛋白质晶体是蛋白质功能研究的瓶 颈，严重制约着蛋白质工程、理性药物设计、合 成疫苗设计等新型生物技术的发展。
蛋白结晶流程图
蛋白表 蛋白纯 蛋白结
达
化
晶
（电荷均一，大小均一）
• 去垢剂（detergent）本身也像膜脂分子一 样的两亲性结构，可以替代膜脂。
蛋白样品的保存方法及注意事项
保存蛋白样品应该遵循的原则：1. 低温低温下保存蛋白质是极其必要的。
低温意味着更低的能量，低温下蛋白质分子热运动较低，其内部的成键不容易断裂。
另外，在低温下，微生物不容易生长，可能存在的蛋白酶的活性也会很低，这些更容易保证蛋白质的活性。
2. 分装蛋白质有时候是需要冷冻保存的，但我们使用蛋白质时却是在室温或者更高的温度。
冻融这一过程会对蛋白质造成不可逆的损伤。
因此我们需要尽量减少冻融的次数。
纯化后的蛋白质，进行分装保存，每次需要多少便融化多少，保证蛋白质样品只经历一次冻融。
3. 浓缩纯化后的蛋白质尽量以高浓度保存，浓度最好在1mg／ml以上，高浓度更有利于蛋白质的稳定。
高浓度的另一个好处是防止蛋白质分子黏贴在塑料或玻璃材质的管壁上。
不要惊讶哟，疏水性蛋白质是很容易粘贴在管壁上的。
4. 速冻／速融（Flash freeze）在蛋白质溶液冷冻的过程中，纯水首先结冰，蛋白质分子会被暴露在极高的盐浓度或pH下，这会破坏蛋白的活性。
因此，需要尽可能缩短冷冻的过程。
速冻可以在液氮中进行，也可以在干冰，乙醇和丙酮的混合物中进行。
速冻后，蛋白质可以保存在-20度或-80度中。
同样的道理，蛋白质融化的过程也要尽可能的快速，可以在温水中进行。
5. 添加剂蛋白质需要保存在合适的缓冲液中。
同时缓冲液中还可以添加一些保护剂，比如保存在-20度时，可以添加10%-50%的甘油，这样可以防止蛋白质冷冻，不需要经历冻融。
同时还可以添加一些抗菌试剂，比如叠氮化钠（sodium azide），可以防止细菌生长。
或者蛋白酶抑制剂（PMSF），抑制蛋白酶对蛋白质的破坏。
另外，还可以添加一些还原剂，如DTT，防止蛋白质的氧化。
在选择添加剂时，一定要保证所加试剂不会影响到蛋白的活性。
保存方法蛋白质的的保存方法的选择完全取决于蛋白质的稳定性以及保存后什么时候再次使用你的蛋白。
1.短期保存（1周内）：对于短期保存，大多数蛋白可以保存在4 摄氏度下。
蛋白结晶技术PPT课件
影响蛋白结晶的因素
蛋白质的纯度
高纯度的蛋白质有利于结晶，因为杂质会影 响蛋白质分子的结晶过程。
温度和压力
温度和压力可以影响蛋白质的稳定性和构象， 进而影响结晶过程。
溶液的pH值和离子强度
适宜的pH值和离子强度可以促进蛋白质分 子的有序排列。
结晶剂
使用不同类型的结晶剂可以调节蛋白质的溶 解度和稳定性，从而影响结晶过程。
疾病机制研究
通过蛋白结晶技术可以研究疾病相关 蛋白的结构与功能，深入了解疾病的 发生和发展机制。
生物标志物检测
蛋白结晶技术也可用于生物标志物检 测，帮助医生诊断疾病和监测治疗效 果。
疫苗研发
了解病毒蛋白的结构对于疫苗研发至 关重要，蛋白结晶技术在此领域具有 广泛的应用前景。
感谢观看
THANKS
通过尝试不同的缓冲液和添加剂组合，寻找适合目标蛋白质结晶的条件。
筛选结晶温度和pH值
在一定的温度和pH值范围内，通过调整温度和pH值，找到适合目标蛋白质结 晶的条件。
晶体生长和优化
晶体生长
在筛选得到的最佳条件下，让目标蛋 白质结晶生长。
晶体优化
通过调整结晶条件或添加添加剂等方 式，对已经形成的晶体进行优化，提 高其质量。
蛋白结晶技术的应用领域
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生物医药领域
用于研究蛋白质的结构和 功能，发现新的药物靶点， 以及开发新的药物。
农业领域
用于研究植物和动物中的 蛋白质，以提高农作物的 产量和品质，以及改善动 物育种。
环保领域
用于研究水处理中的蛋白 质，以去除水中的有害物 质和改善水质。
蛋白结晶技术的发展历程
19世纪末期
蛋白结晶技术的基本原理
蛋白质结晶和蛋白质晶体学方法
蛋白质结晶和蛋白质晶体学方法蛋白质是生命体内最重要的分子之一，也是药物研发、生命科学、工业等众多领域的研究热点。
而对于研究蛋白质，关键的一步就是蛋白质的结晶和晶体学研究。
什么是蛋白质结晶？蛋白质结晶指将溶解在水中的蛋白质在特定的条件下，使其形成一定大小的晶体，以便使用X射线晶体学等技术进行分析结构。
通常情况下，蛋白质结晶需要满足以下条件：溶液中需要有足够浓度的蛋白质分子；结晶试剂可以形成稳定的络合物，可以帮助蛋白质分子快速结晶；结晶条件需要控制好pH、温度、离子强度等因素。
蛋白质晶体学方法蛋白质晶体学方法是一种通过分析蛋白质晶体的结构来了解蛋白质内部结构、功能和作用方式的研究方法。
最常用的是X射线晶体学方法。
利用X射线照射蛋白质晶体，通过测定射线衍射图案来确定蛋白质的结构。
其它方法包括核磁共振（NMR）方法、电子显微技术及光学方法等。
挑战和发展蛋白质结晶和晶体学研究仍然是一个充满挑战的领域。
一方面，很多蛋白质很难结晶或者很难得到足够质量的结晶。
另一方面，即使蛋白质结晶，其结构分析也需要复杂的处理和计算步骤，需要强大的计算机能力和足够的数据存储空间。
更进一步，目前蛋白质晶体学方法虽然已经有了很大的进步和发展，但仍然存在一些不确定性和局限性，例如确定结晶的完整性和误差，以及判断蛋白质在溶液中的行为等问题。
虽然蛋白质结晶和晶体学研究仍然存在挑战和局限性，但是众多研究者依然在探索新的技术和方法，以期在研究蛋白质结构和功能方面达到更深入的了解。
未来的一些新技术，如X射线自由电子激光，以及更加稳定的冷冻电镜技术，都有望在蛋白质结晶和晶体学研究领域有更大的应用前景。
总体来说，蛋白质结晶和晶体学方法在生命科学和药物研发领域的作用已经被证实，是极其重要的研究手段之一。
蛋白质结晶方法大总结
蛋白质结晶方法大总结1.1结晶方法(Crystal lizati on Techniq ues)1.1.1 分批结晶(Batch Crystal lizati on) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。
幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。
一个用于微分批结晶的自动化系统已被Ch ayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。
液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。
1.1.2 液-液扩散(Liquid–LiquidDiffusi on) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。
下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或P EG溶液。
如果有机溶剂如M PD被用作沉淀剂，它会在上层。
以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。
两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。
通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。
再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。
Garc´?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。
蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。
接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。
含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。
沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。
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晶体冻存 – 材料
空气罐
Cryo Tong Tab
Loop
夹子
冻存架 处理晶体工具 晶体
晶体冻存 – 准备液氮
晶体冻存 – 准备夹子
晶体冻存 – 试保护剂（液氮法）
晶体冻存 – 试保护剂（液氮法）
晶体冻存 – 捞晶体
晶体冻存 – 捞晶体
晶体冻存 – 冻晶体
晶体冻存 – 存晶体
晶体装载 – 原理
• • • • • Direct mixing to immediately create a supersaturated condition (Batch Method) Alter temperature Alter salt concentration (salting in or out) Alter pH Add a ligand that changes the solubility of the macromolecule Alteration of the dielectric of the medium Direct removal of water (evaporation) Addition of a polymer that produces volume exclusion Addition of a cross bridging agent Concentration of the macromolecule Removal of a solubilizing agent
Cherezov et al., Science. 2007 318:1258-1265
谢谢！
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A. McPherson, CHSL 2008
晶体培养 – 材料
池液
真空硅脂 蛋白样品
硅化玻片 16孔板
拭镜布
晶体培养 – 真空硅脂
晶体培养 – 加入池液
晶体培养 – 点蛋白溶液
晶体培养 – 混和池液
God, plz give me a crystal so that I can graduate...
Bernhard Rupp, Crystal 101
晶体装载 – 衍射仪
液氮系统
发射器 准直镜
探 测 屏 测角头
照明灯
晶体装载 – 衍射仪
液氮气
X射线
底座
X、Y轴
Z轴
旋转
晶体装载 – 衍射仪（氦气）
晶体装载 – 衍射仪（控制面板）
晶体装载 – 衍射仪
• 记住三点
–检查氦气 –开门摁“DOOR” –别碰紧急按钮，除非很 紧急
晶体装载 – 取晶体
晶体装载 – 取晶体Fra bibliotek晶体装载 – 装晶体
And you pray again... But...
～8Å
在96孔板中培养得到 的β2肾上腺素G蛋白 偶联受体的晶体
晶体被装载到30或 50μm孔径的MiTeGen MicroMounts loop中 微晶衍射图，由27颗微晶得 到了一套完整的2.4Å的数据
技术交流
蛋白质晶体的生长、冻存及装载
晶体培养
A. McPherson, CHSL 2008
晶体培养 – 原理
A. McPherson, CHSL 2008
晶体培养 – 原理
A. McPherson, CHSL 2008
晶体培养 – 原理
A. McPherson, CHSL 2008
晶体培养 – 原理