DNA重组技术

生物工程是更大范围内生产及产品的工程技术，是现代生物
学中一切工程技术的总称，包括：
1.遗传工程：基因工程，物理化学诱变；细胞融合；花粉培育； 有性杂交等。
2．发酵工程
3．酶学工程 4．细胞工程
基因工程
①DNA重组； ②DNA体外诱变； ③体外基因操作； ④基因化学合成
第二节
基因工程的酶学基础
Enzymes
已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。（克隆
羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）
tetr
ner
Psclol
Rb-3
sr
tetr
ner
tetr O ner
tetr ner
Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图
一.现代科学技术发展的特点
(二)科学技术发展的综合化
SV40
λ phage
Paul Berg
我们应该记住他们—— 2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen
1973年，Cohen Group将E. coli 的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒 体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E. coli，在含四环素和 新霉素的平板上筛选出了ter rNer，实现了细菌遗传性状的转移。这是 基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基 因工程诞生的元年。
基因工程的酶学基础 CTGCAG GACGTC -3’ -5’
5’3’-
CTGCA G G ACGTC
3’端凸出（如Pst I切点）
-3’ -5’
第二节
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
基因工程的酶学基础
i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接 两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环
胚胎细胞（核）
去核未受精的卵细胞 母体宫腔
体细胞（核）
去核未受精的卵细胞 母体宫腔
关键区别 克隆的是子代（多生了一个） 复制的是自己（复制了一个）
（三）克隆技术是一把双刃剑
用克隆技术复制人类的假想图
四．基因工程三大理论，三大技术准备
（一）理论上的三大发现
1. 20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。 超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得 阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。 2. 20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型， 搞清楚了生物遗传物质的分子机制。
（1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是 回文序列），与DNA的来源无关。
（2）切割位点：识别位点处。切开双链DNA，形成粘性末端（sticky
end）或平末端（blunt end）。
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 产生粘性末端
5.核酸酶(nuclease) 6.末端转移酶(terminal transferase)
7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)
以1和2最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。
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基因工程的酶学基础
1.限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某
图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出
mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。经过逆转录 mRNA→cDNA性克隆就方便得多。
以上理论和技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和 Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。
禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技 术基础。
2．载体(“交通工具车子”)
直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一 直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二 个技术准备。
（二） 技术上的三大发明
3．逆转录酶
1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破 了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。 真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。即使有了基因
第二节
切开一条单链。
基因工程的酶学基础
（2）切割位点：在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机
Recognize site 1-1.5kb
cut
（3）作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
第二节
1.2.2 II类限制性内切酶
基因工程的酶学基础
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分 离出来。分离的第一个酶是Hind Ⅱ。
定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。
（二）重组DNA技术(DNA recombination technique)
重组DNA技术是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切 割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。基因工程包括DNA
重组技术。
（三）生物工程（Biologic engineering）
1.19世纪中叶，科学和技术是二者分离的，它们各有独自文化 传统，它们的发展往往是脱节的。 2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎 么做”。当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体 现科学。 3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。突破是线 性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融 合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自 身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶： GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶： CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基
第二节 基因工程的酶学基础
I 型限制性内切酶
第二节
基因工程的酶学基础
常用的工具酶（tool enzymes）：
1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)
2.DNA连接酶（DNA ligase,ligase) 3.逆转录酶(reverse transcriptase)
4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)
EcoR V
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平末端
第二节
基因工程的酶学基础
（3）粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端。
5’3’5’3’-
GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G
5’端凸出（如EcoR I切点）
-3’ -5’ -3’ -5’
第二节 5’3’-
接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组 体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得 到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上 进行，所以也称分子克隆。
二．基因工程的概念
1.“基因剪刀” ：剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”。 2.“缝纫针” ：连接不同来源DNA分子的酶就像一根
1.2限制性内切酶的类型
1.2.1 I型限制性内切酶
II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的，如 EcoB和 EcoK。
（1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
形分子。
② 5’末端标记：凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA
或TTT等）造成人工粘性末端。
③ 补平成平齐末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
第二节
基因工程的酶学基础
（5）同裂酶（Isoschizomers)：识别位点的序列相同的限制性内切酶。
五．与基因工程相关的概念
（一）克隆（clone,cloning） 1.原意是指单细胞纯系无性繁殖。
2.现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适
当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利 用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由
于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular
种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核 酸内切酶。来源于原核生物，属于核酸内切酶，即在核酸分子 链的内部制造切口的酶。
1.1限制与修饰现象
细菌的限制和修饰系统（R/M体系），是细菌的一种自我
保护作用。
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断
第一章 DNA重组技术
讨论4个问题：

1.什么是基因工程——基因工程的概念。 2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。
（包括3大理论和3大技术准备）

3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重 组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）

4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基 因工程产品、开展基因治疗等。
① 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
② 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。