细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告范文
分离、筛选、鉴定色氨酸营养缺陷型菌株
分离、筛选、鉴定色氨酸营养缺陷型菌株一、实验目的1、了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法2、初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的方法技术，体会相应的科学理念。
二、实验原理1、诱变及诱变剂说明1.1利用化学、物理等诱变手段是微生物育种工作的常用手段主要有DNA碱基化学性质改变引起置换、插入移码、大片段畸变、碱基二聚体形成等，最终引起宜春啊信息复制之中的改变1.2本次试验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变的目的）1.3诱变后需要暗培养（防止光复活作用）1.4紫外线剂的控制---紫外灯的功率、照射距离、照射时间（需要前期试验确定，杀菌率在70%左右）2、营养缺陷型的培养生长情况营养缺陷型在完全培养基上生长良好，而在基本培养基上则不生长，未发生突变的野生型在两种培养基上都能生长（此为筛选的理论依据）三、实验材料菌种：大肠杆菌实验培养基：肉汤液体培养基（CM）；肉汤固体培养基（CMA）；2倍肉汤液体培养基（CM）；基本液体培养基（MM）；基本固体培养基（MM）；含色氨酸的基本培养基实验试剂：生理盐水，青霉素钠实验器材：10ML带盖离心管、10ml吸管、90mm培养皿、试管四、实验步骤1、菌种培养收集洗涤大肠杆菌接种于肉汤液体培养基，37℃静止培养18~24h无菌取10ml培养液放入无菌15ml离心管中，3500r/min 10min，弃上清液，留下菌体沉淀在上述沉淀中加入5ml无菌生理盐水，悬浮沉淀，备用2、诱变剂处理吸取上述洗涤悬液3ml，放至60mm培养皿中，摇晃成薄层。
将上述培养皿放在40w紫外灯下，距离30cm（处理前先开紫外灯稳定30min），灭菌1min，然后开盖处理5min。
照射完毕后，先盖上皿盖，再关紫外灯吸取3ml2倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。
置于37℃恒温培养箱内，避光培养12h以上（此时是诱变后DNA复制形成纯合子过程）注意：紫外线防护，不要长时间暴露在其下3、淘汰野生型，浓缩缺陷型—基本培养基抗生素法：青霉素适用于细菌，制霉菌素适用于真菌菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌4、鉴定色氨酸营养缺陷型持续观察，前后对照标记，在基本培养基上不生长，但是能在加了色氨酸的基本培养基上生长的便是色氨酸营养缺陷型菌株。
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
实验三营养缺陷型的筛选
实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。
二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。
2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。
(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。
配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。
(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。
(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。
3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。
(2) 水溶性维生素混合液。
(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。
4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。
四、实验内容1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。
大肠杆菌营养缺陷型
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选陈瑞州201110424108一.实验原理以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如维生素）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株称为营养缺陷型。
常用的诱变法是紫外线照射诱变法。
但是，经处理后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细菌。
因为抗生素能杀死生长的细菌而对不生长的细菌没影响，而缺陷型菌株在基本培养基中不能生长，由此通过含有抗生素的基本培养基即可淘汰野生型细菌，保留缺陷型细菌。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后，将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上，凡是在基本培养基上不长，而在完全培养基上生长的菌落就是营养缺陷型。
二.实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌三.实验器具和药品1.用具：灭菌培养皿（9cm），灭菌三角瓶（150ml），灭菌离心管。
2.培养基1)肉汤液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100ml，Ph7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。
2)肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水50ml，Ph7.2，高压灭菌锅15磅/英寸215分钟。
3)基本液体培养基：葡萄糖2g，蒸馏水98ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟4)基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
5)无N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
6)2N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。
[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。
[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。
其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。
通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。
在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。
一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。
本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。
此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。
在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。
当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。
如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
细菌营养缺陷型的诱变和筛选
微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。
紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。
筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。
又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。
关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。
微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。
如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。
用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。
用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。
夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
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工业微生物育种实验
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定
关于菌株的几个概念：
野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同
关于培养基：
基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法
一、实验目的
1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、实验原理
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材
离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针
四、实验材料
(一)菌种E.coli
(二)培养基、
1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min
22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O
0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌
20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。
全部药品需用分析
纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
4无N基本液体培养基：
K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min
52N基本培养基：
K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min
6完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。
7混合氨基酸和混合维生素
五、实验步骤
(一) 诱变处理
1th day，接种：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜。
2th day，诱变：早上添加5mlLB液，继续培养5小时，取5ml菌液与离心管中，离心（3500rpm）10分钟（注意配平，相对两管相差不超过0.01g），弃上清，加生理盐水5ml，打匀沉淀，吸菌液3ml于75mm培养皿内，将培养皿置于15W 紫外灯下30cm处（处理前紫外灯预热30min），将培养皿连同盖一起置于15W 紫外灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射1-3min，照射后先盖上皿盖再关灯。
吸3ml 2倍LB液加入处理过的菌液平皿内，混匀，用黑布（纸）包好，置37℃避光培养12h以上。
(二) 营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）
3th day，延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。
离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最
后加生理盐水制成5ml菌悬液。
取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。
（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4th day，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。
（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。
缺陷型因不长避免被杀死）。
5th day，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。
(三) 营养缺陷型检出
7th day，检出营养缺陷型。
上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。
选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。
9th day，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。
(四) 营养缺陷型鉴定
在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法。
单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。
将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。
如果以15种维生素进行测定，则把5种维生素归为一组，共5个组合。
1 赖氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸异亮氨酸
组别氨基酸组合组
2 缬氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸
3 苏氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸
4 丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸丝氨酸
5 鸟氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺
6 胍氨酸异亮氨酸组氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺
10th day ，生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml LB 液试管中，37℃培养14－16h 。
11th day ，培养16h 的菌液离心。
3500rpm ，10min ，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。
加5ml 生理盐水制成菌悬液。
取其1ml 于培养皿中，加入融化后冷却到40－50℃的基本培养基，混匀，平放，共二皿。
（平板表面分别沾上沾有混合氨基酸(或酪素水解液)的滤纸片，30℃培养 24h ，经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为氨基酸的营养缺陷型菌株）。
将皿底分成分格用接种环依次放入少许混合氨基酸等，37℃培养24h ，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。
生长谱鉴定点样图示
六、实验结果与分析
1、营养缺陷型检出
点植对照时每平皿点30株菌，最后基本培养基只有100#菌没有长出，即筛选出一株营养缺陷型菌株。
组别 维生素组合组
1
维生素A
维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B12 2 维生素C 维生素B1 维生素D2 维生素E 烟酰胺 3 叶酸 维生素B2 维生素D2 胆碱 泛酸钙 4 对氨基苯甲酸 维生素B6 维生素E 胆碱 肌醇 5
生物素
维生素B12
烟酰胺
泛酸钙
肌醇
叶酸
嘧啶 B 组维生素
腺嘌
呤
1
2
3
5
4
右图中1、2、3、4、5均为氨基酸组合
图1
2、营养缺陷型鉴定通过如图1生长谱鉴定，得到如图2结果：
生长谱鉴定结果图
分析：可以观察到2.4号滤纸片周围有生长圈。
通过查表鉴定为脯氨酸缺陷型。
七、实验结论与讨论
结论：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后
经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
讨论：1、注意事项：紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中应避免人体暴露在紫外线中。
各种器具、培养基及需加入培养基中的试剂均
需灭菌。
2、本实验中的突变型是氨基酸缺陷型，我们是可以检测的，如果是
与N元素代谢有关的其他缺陷型，我们无法通过这个实验检测。
3、本实验中经紫外线照射后，诱变率较低，可能是因为照射时间短，
诱变剂量小，或者是黑暗培养不完善导致光复活作用，可将诱变
后的菌体进行后培养。