双向电泳操作步骤
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
简述双向电泳技术分离蛋白质的基本技术流程
简述双向电泳技术分离蛋白质的基本技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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双向电泳操作步骤
3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。
参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。
用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。
离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。
置于冰上裂解2h。
13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。
用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。
加入300μL沉淀剂。
振荡或倒置搅匀。
冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。
保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。
后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。
将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。
在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。
-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。
小心地将上清液移走弃去。
此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。
振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
双向电泳实验操作流程
双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。
根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。
考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。
2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。
DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。
清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。
3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。
上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。
以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。
说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。
在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。
上样后即可进行IEF电泳。
注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。
一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。
4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。
将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。
双向电泳操作流程
双向电泳完整操作流程仪器：Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机（Beckman Coulter）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare）、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪（GE Healthcare）、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件（GE Healthcare）、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT样品水化液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚兰平衡缓冲液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。
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双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤及相关溶液配置
A(实验过程
一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:
1. 样品的溶解
取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,
10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各
管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)
3.1 水化液的制备
称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，
振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶
分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
注意:胶条使用前，要在室温中平衡30分钟;加样时，正极要多加样，以防气泡的产生;压胶
时不能产生气泡;酸性端对应正极，碱性端对应负极;样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。
3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时
其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸干(再次冲洗过程也可省略)，然后用镊子夹住胶条以正极端(即酸性端)向下，负极端(即碱性端)向上，放入用来平衡的试管中(镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为
标记)，用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。
注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。
平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合;同样在第二次平衡时，煮5,的琼脂糖10ml。
4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配胶(两根胶条所用剂量)
分离胶:(T=8, 80 ml):溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED
30 , 丙烯酰胺储液 21.28ml
分离胶buffer 20ml 10,APS 220ul TEMED 44 ul
双蒸水 38.72ml
浓缩胶:(T=4.8, 10ml)
30 , 丙烯酰胺储液 1.6ml
浓缩胶buffer 2.5ml 10,APS 30ul TEMED 5ul
双蒸水 5.9ml
4.2 灌胶
将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏
胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒
入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。
4.3 转移
剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。
然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5,的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝
胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG
PAGE胶面,其中不断补加5,的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
胶条缓缓加入SDS—
4.4 跑胶
浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时
5. 银染(两根胶条所用剂量)(银染特别注意用超纯水)
5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml 5.2 敏
化 30min 无水乙醇 150ml
Na2S2O3•5H2O 1.5688g
无水乙酸钠 34g
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml 5.3 洗涤
5min × 3次
5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml
5.5 洗涤1min × 2次
5.6 显影无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml
甲醛(37,)0.1ml, 临时加
5.7 终止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超纯水定容至500ml 5.8 洗涤 5min × 3次
注:整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。
B实验相关试剂配制
1.Bradford 工作液
95,乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85,磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。
过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存(Bradford不稳定，一周内有效) 2.裂解液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4,
DTT 60 mM
40 mM(如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5,的Pharmalate) Tris—base
3. 水化液储液
尿素 8M
2M 硫脲
CHAPS 4,
Tris—base 40 mM
4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4, 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4, 0.4g Tris—HCl 0.5M 6.07g 6.凝胶储存液(30,的丙烯酰胺) 250ml Acr 29.2, 73g Bis 0.8, 2g
7. 电极缓冲液(跑一次要配制2500ml)
甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml
8.0.5M Tris —HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9.平衡液储液
脲(即尿素) 36g
甘油 30, 30ml
SDS 1, 1g
0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml 10. 平衡液A(一根胶条) DTT 20mg 平衡液储液 10ml 11(平衡液B(一根胶条)
碘乙酰氨 300mg 平衡液储液 10ml
15ul (平衡液A、B均需临时配制) 0.05,溴酚兰
12(0.5,琼脂糖10ml
0.05g 琼脂糖
电极缓冲液 10ml 溴酚兰 25ul 补:4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。