细胞爬片免疫组化
细胞爬片染色步骤
免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。
阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
细胞免疫组织化学实验流程及注意事项
九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。
贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。
需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。
之后可按组化常规方法进行。
封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。
另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。
使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。
免疫细胞化学步骤及说明
1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。
六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。
分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。
关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。
2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。
4℃PBS，洗5min×3次。
吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。
这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。
3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。
固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。
(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。
PBS洗5min×3次。
(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。
PBS洗5min×3次。
细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。
(4)BSA封闭，室温10min。
倾去，勿洗。
(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。
PBS洗5min×3次。
抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。
(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。
PBS洗5min×3次。
(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。
蒸馏水充分冲洗。
(8)苏木素染2min。
自来水充分冲洗。
(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。
封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。
后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。
而且二甲苯太呛人了。
(10)中性树胶封片。
爬片和组化的实验步骤
爬片和组化的实验步骤实验九组织切片与细胞爬片/涂片的HE染色【实验目的】1．掌握细胞涂片的HE染色方法2．熟悉细胞涂片及爬片的制备方法【实验原理】苏木素-伊红染色又称HE染色，是目前应用最广泛的染色方法。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色主要用于显示各种组织的正常成分和病变组织的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。
HE 染色适用于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片、冰冻切片和细胞涂片，且切片不易褪色，可以长期保存。
HE染色在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。
【实验方法】1．细胞爬片的制备（1）将灭菌的载玻片放入培养板内。
（2）将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中，根据实验目的选择培养基或加入药物。
（3）将孔板放入37℃二氧化碳孵箱中孵育数小时或过夜，待细胞的贴壁密度符合实验要求时，吸去孔板内的培养基或药物，用37℃预温的0.1mol/LPBS漂洗一次。
（4）吸去孔板内的PBS液，加入4%多聚甲醛室温固定15～30min。
（5）吸去4%多聚甲醛，用PBS漂洗3次，每次间隔3min。
（6）取出细胞爬片，晾干后存放于-20℃或直接进行染色。
2．细胞爬片的制备备选方法将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中（24孔），根据实验目的选择培养基或加入药物，培养到预定时间点。
取出培养板，1000rpm离心5min后，弃上清。
每孔加入PBS2ml,1000rpm离心5min，弃上清；重复1次，共进行2次洗涤。
3．细胞涂片的制备收集处理的细胞，PBS洗2次后，调细胞密度为0.3～0.5某106/ml,按照每片0.1ml，用涂片离心机制备涂片；或者调细胞密度为0.3～0.5某107/ml,取0.005ml涂于载玻片上。
细胞爬片免疫组化步骤
1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。
（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。
5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。
6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。
8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。
10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
11.显色剂DAB显色。
细胞免疫组化
步骤（SP三步法，也可选择其它方法）：1、固定：4%PFA或丙酮甲醇1：1固定细胞爬片室温20min，然后用PBS洗3遍，3min/次；2、细胞通透：用终浓度为0.3%的triton（溶于PBS）通透细胞，约室温半小时；但丙酮可以省略这一步。
3、浸洗：PBS 3*3min/次；4、封闭：一般用5%羊血清（与二抗来源一致，但也可用BSA）室温封闭10-30min；5、一抗孵育：用合适的一抗浓度先4℃过夜，然后37度或室温复温45min；6、浸洗：PBS 5*5min/次；7、二抗孵育：用生物素标记的二抗孵育37度0.5-1h，或室温1-2h；8、浸洗：PBS 5*5min/次；9、SP反应：孵育37度0.5-1h；10、浸洗：PBS 5*5min/次；11、DAB显色：一般3-10min，具体时间由镜下看到背景来控制；12、苏木素复染、封片、镜下观察。
PBS 3*5 min/次，镜下观察细胞免疫组化的具体步骤:1.载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。
2.培养细胞也可涂片或贴片生长。
3.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定30分钟；对不能耐受甲醛固定的抗原，纯丙酮室温固定30分钟。
蒸馏水洗。
（干燥后可冰冻保存）4. 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次。
5.滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体, 不洗。
6．滴加适当稀释的一抗（小鼠或兔IgG），37 ℃ 1小时左右或20℃时2小时左右。
也可4℃过夜。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。
一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
）7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔、人IgG),20-37℃ 20分钟。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
免疫组化（总结）
免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。
常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。
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固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）：
我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。
0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml
磷酸氢二钠48.693g
磷酸二氢钠 5.023g
三蒸水1000ml
12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml
多聚甲醛125g
三蒸水1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，如仍不溶，加NaOH
（三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml）
4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml
12.5%多聚甲醛320ml
0.1m PB 680ml
步骤：
1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。
2 PBS清洗标本3次各1 min。
3 冰丙酮固定15 min。
4 空气干燥5min。
5 PBS清洗标本3次各2 min。
6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。
7 PBS清洗标本3次各2 min。
8 3%H2O2孵育15 min。
9 DPBS清洗标本3次各2 min。
10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。
11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。
阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液
12 PBS清洗标本3次各5 min。
13 二抗工作液孵育（湿盒）37OC 30 min。
14 PBS清洗标本3次各5 min。
15 C液（湿盒）37O C30 min。
16PBS清洗标本3次各5 min。
17DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。
18蒸馏水洗2次1 min。
19苏木素复染0.5~1min。
20自来水洗30min。
21树胶封片。
注意事项：
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：
（1）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；
（2）接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4O C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。