MGMT 甲基化试剂盒研发
mgmt甲基化的原理
mgmt甲基化的原理
MGMT基因的甲基化是指MGMT基因启动子区域中的CpG岛发生了甲基化修饰。
正常情况下，MGMT基因启动子区域的CpG岛是非甲基化的，这使得MGMT基因能够正常表达。
然而，当MGMT基因启动子区域的CpG 岛发生甲基化修饰时，会导致该区域的DNA序列上的CpG位点被添加了
甲基基团，从而抑制了MGMT基因的转录和表达。
这样一来，肿瘤细胞中MGMT蛋白的表达水平就会降低，影响了肿瘤细胞对DNA损伤的修复能力。
对于某些肿瘤患者来说，如果其MGMT基因启动子区域发生了甲基化修饰，通常意味着该患者对于DNA损伤类化疗药物的治疗反应较好。
这是因为甲基化修饰导致MGMT基因表达受到抑制，肿瘤细胞的DNA修复能力降低，从而增加了DNA损伤类化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。
以上内容仅供参考，如需更专业的内容，建议查阅关于MGMT甲基化的文献、资料或咨询相关学者。
MGMT甲基化-SOP
MGMT甲基化检测SOP(简)1 组织DNA提取纯化并测定浓度;2 取200-500ng DNA，补水至体积到20ul（不足200ng的样品，直接取20ul DNA 溶液）;3 按照EZ DNA Methylation-Gold kit 操作步骤处理DNA；4 以步骤3处理后的DNA样品为模板，按以下体系程序进行两次扩增：5 PCR扩增引物序列（由invitrogen合成）反应体系：30 μl PCR体系:Prime 1.5μl10*buffer 3μldNTP 2 μlddH2O 21μlrTaq 0.4μlTemplate 2μl(>50ng).扩增步骤95°C 2 min94°C 30 s40* 59°C 30 s72°C 30 s72°C 5 min16°C ∞第二步：反应体系30 μl PCR体系:Prime 1.5μl10*buffer 3μldNTP 2 μlddH2O 22μlrTaq 0.4μlTemplate 1μl.扩增步骤95°C 2 min94°C 30 s40* 59°C 30 s72°C 30 s72°C 5 min16°C ∞6 在3%的琼脂糖凝胶电泳上检测7结果判定情况1：MGMT-SFR（甲基化引物）有扩增MGMT-PFR（非甲基化引物）无扩增该样品为完全甲基化情况2 ：MGMT-SFR（甲基化引物）无扩增MGMT-PFR（非甲基化引物）有扩增该样品无甲基化情况3：MGMT-SFR（甲基化引物）有扩增MGMT-PFR（非甲基化引物）有扩增该样品为半甲基化。
人O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶MGMT酶联免疫分析
人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T 4pg/ml -200 pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)水平。
用纯化的人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)，再与HRP标记的O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)浓度。
试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)酶联免疫分析
人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T4pg/ml -200 pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)水平。
用纯化的人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)，再与HRP标记的O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)浓度。
标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
脑胶质瘤分子诊断系列（二）：MGMT甲基化
脑胶质瘤分⼦诊断系列（⼆）：MGMT甲基化很多恶性脑胶质瘤患者对烷基化化疗药物没有治疗效果。
在脑胶质瘤中肿瘤细胞抵抗烷基化药物的主要机理是由O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）所介导的DNA修复过程。
MGMT是定位在10q26染⾊体，其启动⼦包括富含97个CG⼆核酸（CpG位点）的CpG岛。
在正常组织中，CpG位点⼀般都处在⾮甲基化状态。
CpG位点甲基化会导致染⾊体结构改变，从⽽抑制启动⼦与转录因⼦的结合、导致基因沉默。
MGMT在细胞的DNA错配修复过程中起着重要的作⽤，MGMT主要分布于细胞质中,当DNA损伤后其会转移到细胞核中介导DNA的错配修复过程。
在细胞核中MGMT可以使烷化剂作⽤下形成的O6-位甲基化鸟嘌呤去甲基化，有效地修复DNA损伤。
有趣的是当MGMT修复完DNA中的烷基加合物后，MGMT⾃⾝也不可逆的同烷基加合物被泛素化途径被降解。
因此MGMT也被称为“⾃杀”蛋⽩。
图1为MGMT介导的DNA修复过程。
烷基化药物替莫唑胺（TMZ）能使DNA中的鸟嘌呤形成O6-位甲基化鸟嘌呤，⽽MGMT通过共价转移从O6-meG中螯合出甲基，从⽽将鸟嘌呤恢复到正常状态。
错配的O6-meG-胸腺嘧啶碱基对被错配修复途径（其包括MLH1，MSH2，MSH6和PMS2蛋⽩）识别，同时进⼊⽆效的修复循环并导致细胞死亡。
由于MGMT在TMZ引起的DNA中错配修复过程中起着重要的作⽤，检测MGMT的表达情况能能够很好的预测肿瘤患者是否对烷基化疗药物TMZ具有耐药性。
因此研究MGMT的基因表达机理能为肿瘤的临床化疗提供基本的理论依据。
⽬前研究得⽐较透彻的MGMT表达机理主要有以下⼏种：第⼀种调控⽅式是MGMT启动⼦CpG岛区的甲基化修饰调控；MGMT启动⼦区具有98个CpG岛区，研究标明在很多原发性的肿瘤细胞中，MGMT启动⼦的CpG岛区被甲基化⽽引起MGMT基因沉默。
MGMT蛋⽩的表达也可以通过组蛋⽩修饰和转录激活因⼦或抑制因⼦的异常表达或功能障碍来调节；研究表明组蛋⽩H3K9的甲基化增加和MeCP2与MGMT启动⼦区域的结合均显⽰与启动⼦甲基化和转录下调相关。
甲基化试剂盒中文说明书
产品详细描述：在 3 小时内完全转化富含 GC的 DNA. 两次加热变性的反应步骤简化了由未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的过程 .没有DNA 沉淀.并且通过柱层析一步完成DNA的纯化和脱硫.洗脱的超纯 DNA 对于一系列的分子生物分析是非常理想的。
描述EZ DNA Methylation-Gold KitTM 是我们 EZ DNA Methylation Kit产品的改进版. EZ DNA Methyl ation-Gold Kit 将 DNA 变性过程和亚硫酸氢盐转变过程转化为一步.此步骤采用温度变性来取代以前方案中使用氢氧化钠的化学变性过程. 经过DNA亚硫酸氢盐转变,试剂盒可大量回收到 DNA .两种试剂盒都是基于在胞嘧啶与亚硫酸氢钠之间发生的使胞嘧啶转变为尿嘧啶的三步反应. EZ DNA Meth ylation-Gold 与 EZ DNA Methylation Kits 都采用创新的柱内脱磺酸技术来减少不必要的DNA沉淀步骤以便每次都可以提供给研究人员较好的结果.试剂盒的设计可以减少模版降解和纯化过程中的DNA损失, 并且完全转化未甲基化的胞嘧啶.回收的DNA对于PCR扩增、限制性内切酶消化、测序、微阵列等下游分析是很理想的. 右图是 EZ DNA Methylation-Gold Kit所呈现出的结果.在经过亚硫酸氢盐处理后的DNA 测序结果. 使用EZ DNA Methylation-Gold Kit处理的甲基化的Cm pG (在 #5核苷酸位点)DNA.回收的DNA通过PCR来扩增并且直接测序.在 #5位置上甲基化的胞嘧啶仍然保持完整,当未被甲基化的胞嘧啶 (i.e., positions #7, 9, 11, 14 and 15)通过亚硫酸氢盐处理完后全部转化为尿嘧啶.试剂制备CT Conversion Reagent的制备试剂盒中所提供的CT Conversion Reagent是固体混合物并且一定要在首次使用前制备好. 通过添加 900 μl 水, 50 μl 的 M-Dissolving Buffer, 和 300 μl 的 M-Dilution Buffer 到一管的CT Conversion Reagent中. 在室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟. 如果看到没有溶解的试剂是很正常的, 因为在溶液中的 CT Conversion Reagent 已经达到饱和状态.在使用之前将 CT Conversion Reagent 溶液在室温 (20°C -30°C)下避光保存.每管的 CT Conversion Reagent 是针对10次 DNA 处理设计的.为了得到较好的结果, CT Conversi on Reagent 应当在制备后立即使用.如果不立刻使用的话, CT Conversion Reagent 溶液可以在-2 0°C存储1星期.而且在使用之前存储的 CT Conversion Reagent 溶液一定要在室温下解冻并且通过震动或颠倒2分钟来混合. CT Conversion Reagent 对光很敏感,所以要尽量减少在光下的暴露.M-WASH BUFFER的制备添加24ml (对于200次的D5006应为96ml) 100%的乙醇到M-WASH BUFFER中来制备最终可以使用的M-WASH BUFFERProtocol：每次制备的DNA 范围在 500 pg 到 2 μg之间. 最佳量为200-500 ng.在PCR管中添加 130 μl 的 CT Conversion Reagent 到每 20 μl DNA 样品中. 如果 DNA 样品的体积小于 20 μl, 则用水来弥补差量. 通过轻弹试管或移液器操作来混合样品.For Example: 4 μl DNA 样品, 加入16 μl 水, 130 μl CT Conversion ReagentNote: 对于 DNA 体积 >20 μl, 就要调整 CT Conversion Reagent的制备过程. 对于每增加 10 μl DNA样品体积来说，水的量就要随之减少 100 μl. 例如, 40 μl DNA 样品, 就要添加 700 μl来制备 CT Conversion Reagent. DNA 样品的最大体积为每次转化反应50 μl. 不要调整 M-Diss olving Buffer 或 M-Dilution Buffer的体积.将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作:1. 98°C 放置 10 分钟2. 64°C放置2.5 小时3. 立刻进行下述操作或者在4°C 下存储(最多20小时).添加 600 μl 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 中，并将柱放如试剂盒所提供的Col lection Tube中.装填样品 (从步骤 2)到 Zymo-Spin IC? Column 含有 M-Binding Buffer. 盖上盖将柱颠倒数次来混合样品.全速 (>10,000 x g)离心 30 秒. 去除流出液.添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速离心30 秒.添加 200 μl 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室温 (20 °C- 30 °C) 下放置 15-20 分钟. 在培养后, 全速离心 30 秒.添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速离心30 秒. 再添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 并且离心 30 秒.直接添加 10 μl 的 M-Elution Buffer 到柱基质中. 将柱放置在 1.5 ml 的管中. 全速离心来洗脱 DNA.DNA 可立刻进行分析或储存在低于-20°C 下以备以后使用. 我们建议您对于每次PCR使用 2 - 4 μl洗脱的 DNA.。
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甲基化灵敏度
• 采用MGMT基因启动子50%的甲基化参考 品，按照比例依次稀释，依次构建
50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%
应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考 品对掺正常人类基因组转化液（按照400copies/ul-
6copies/ul每一个浓度都加上正常人类基因组转化液）
应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯 度参考品并且对临床正常样本转化液进行进一步定量
临床正常样本转化液 2*103copies/ul
400copies/ul
4 copies/ul
80 copies/ul 16 copies/ul
结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类 基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于在反应体系中不添加任何添加剂对检测的效果较好;
分析性能评估
1.特异性考察 2.梯度标准品验证 3.反应体系稳定性 4.灵敏度考察
针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模 板检测应用甲基化检测探针检测其特异性
结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床 正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检 测信号。
人类MGMT基因（启动子） 甲基化检测(MSP法)试剂盒 研发项目分享
主讲人：刘骏珲 技术支持：刘旭宏
抑癌基因
它可以通过多种信号传导途径 以及蛋白-蛋白之间的相互影响起 作用，影响细胞生长、分化、转移 、粘连、增殖及细胞周期，促进凋 亡，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。
MGMT基因启动子
• 1.与癌症相关
应用甲基化检测探针检测其MGMT 基因甲基化梯度参考品
200copies/ul 400copies/ul
6copies/ul 12copies/ul
100copies/ul50copies/ul 25copies/ul
实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板，灵敏度为可以为检测到 6copies/ul
应用转化液通检探针检测其MGMT 基因甲基化质粒梯度参考品并且对 临床正常样本转化液进行初步定量
2*108copies/ul 2*109copies/ul 2*1010copies/ul
临床正常样本转化液
2*107copies/ul 2*106copies/ul 2*105copies/ul 2*103copies/ul 实验结果表明：目前梯度稀释范围从2*1010copies/ul到2*103copies/ul，临床正常样本 转化液lCt值位于2*103copies/ul之后，需要进一步定量
反应体系优化
• 1.体系中Buffer，Mg2+,引物浓度等优化。
• 2.添加剂优化：蔗糖，NH4+, BSA
针对基因组DNA转化模板检测体 系添加剂体系筛选
F1R2+PROBE2 F1R2+PROBE2+20um蔗糖 F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+
1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA
淬灭探针
• 甲基化长探针
FAM
BHQ
BHQ
针对基因组DNA转化模板探针以 及引物HAND的筛选实验
F1R2+POBE2 AT-F1 AT-R2+POBE2
AT-F1 AT-R2+PROBE1 F1R2+PROBE1
实验结果表明：AT-F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用 这对引物作为检测引物
脑胶质癌
肠癌 MGMT基因启动子发生甲基化 口腔癌
肠癌
研发思路
MGMT甲基化检测试剂盒研发
引物的筛选
引物性能的评估
引物优化比例的确定 初步检测体系的建立
多因素优化设计
DNA质控体系建立，甲基化标准品合成
基因残留质控
转化成功质控
98%转化参考品构建
筛选合格样本
甲基化浓度梯度参考 品
甲基化水平的检出
检测流程的建立
分析性能评估
HANDS系统的引入
检测体系建立
检测位点确定
• 通过文献调研确定MGMT基因启动子区域 • 甲基化CpG岛预测并与文献比较
ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7个潜在CpG位点
MGMT甲基化标准品构建
• 1.确定目标序列，设计引物 • 2.重叠延伸PCR制备DNA • 3.菌液培养 • 4.浓度标定 • 5.测序验证
质量控制体系的建立
参考品构建
98％转化液构建 由100％人类基因组转化液与人类基因
组按比例对参得到
1：1甲基化参考品 由100％人类基因组转化液与甲基化质
粒标准品按比例对参得到
应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因 甲基化梯度参考品
2*107copies/ul-2*103copies/ul 结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释2*103copies/ul在Ct值上与400ng转化人类基 因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标准品
整体效果
质粒梯度不惨正常人类基因组转化液
只加正常人类基因 组转化液
NTC 质粒梯度对掺惨正常人类基因组转化 液
THANK YOU
非甲基化探针P
完全转化且位 点完全甲基化
甲基化长探针M
3 3
DNA重亚硫酸盐转化体系确定
• 供应商选择 1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215) 2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒 3.EZ DNA Methylation™-GOLD Kit
• 转化程序选择
1. 98°C for 10 minutes
2. 53°C for 30 minutes
针对基因组DNA转化模板检测体 系少量临床样本检测
实验结果表明：目前体系可以对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT启动子的检测， 只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR
针对基因组DNA转化模板检测体系 灵敏度深入考察
8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍 实验结果表明：针对基因组DNA转化模板检测体系，可以检测到转化液稀释 512倍相当于基因组拷贝数12
3. 53°C for 6 minutes
OR
4. 37°C for 30 minutes
5. 4°C storage（3-4步 8循环）
qPCR体系建立
三大体系
• G体系 针对人类基因组DNA设计
• P（非甲基化）体系 根据转化后序列（非CpG位点设计探针）
• L（甲基化）体系 覆盖CpG位点（全甲基化）的长探针
引物探针设计
• HANDS系统引入
1.减少引物二聚体 2.增加结合效率 3.增加酶切活性 4.保护碱基
HANDS系统
5
3
3
5
针对基因组DNA转化模板引物的筛选实验
F1R2 F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3 R2;F3R3;F4R2
实验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作 为检测引物
100copies/ul
200copies/ul 400copies/ul
6copies/ul 12copies/ul 25copies/ul 50copies/ul
以上浓度梯度均加入2.5ng正常人类基因组转化液构成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%） 参考品
实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板灵敏度为2.4%