MGMT-甲基化试剂盒研发
好消息！基因科技MGMT检测产品正式获批上市
好消息！基因科技MGMT检测产品正式获批上市 2019年2月27日，基因科技（上海）股份有限公司自主研发并具有自主知识产权的产品——人类MGMT基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）正式获得国家药品监督管理局（NMPA）批准，是国内临床领域首个合规获批的MGMT基因甲基化检测试剂盒。
该产品可应用于筛选出脑胶质瘤样本中MGMT基因的甲基化状态检测，使得临床检测MGMT基因甲基化更安全、更有保障。
精彩内容输出中，请接收哦！胶质瘤是一类起源于神经胶质细胞的肿瘤，也是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，其发生率约占整个中枢神经系统恶性肿瘤的80%。
替莫唑胺（简称TMZ）是新一代烷化剂，可以对DNA上的鸟嘌呤O6位进行甲基化修饰，使DNA错配修复系统紊乱，最终阻碍DNA复制而导致细胞凋亡。
在欧洲和美洲开展的多项大规模Ⅲ期临床试验证实TMZ联合同步放疗后，再增加6个疗程的TMZ辅助化疗，可显著延长脑胶质瘤患者生存期，从而确立了TMZ作为脑胶质瘤化疗一线药物的地位。
尽管TMZ对恶性脑胶质瘤的疗效显著，但是存在明显的个体化差异。
TMZ的疗效与患者肿瘤组织中MGMT基因的甲基化状态密切相关。
MGMT基因编码产物为O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶，它是人体内一种重要的DNA修复酶。
如果肿瘤组织中MGMT基因未发生甲基化，基因正常表达，可以将鸟嘌呤O6位置的甲基修饰基团转移到半胱氨酸残基，从而修复DNA损伤，导致烷化剂药物无效。
当MGMT基因发生甲基化时，基因停止转录，鸟嘌呤O6位置的甲基基团转移失败，不能有效修复DNA烷化损伤，临床使用烷化剂药物有效。
因此，MGMT基因的甲基化状态可以作为胶质瘤患者化疗敏感及预后好的预测指标。
早在2012年，《中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南》就推荐有条件的单位检测患者的MGMT基因甲基化状态，指导化疗药物的选择。
2014年发布的《中国脑胶质瘤分子诊疗指南》中进一步明确指出：存在MGMT基因甲基化的胶质瘤患者对化疗、放疗更敏感，采用替莫唑胺治疗的效果更佳。
甲基化实验步骤
MGMT甲基化检测实验步骤一．亚硫酸氢钠处理DNA（将未甲基化的胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶）使用EZ DNA（北京中西远大科技有限公司）甲基化试剂盒处理样本。
二．DNA样本的处理1.取130微升的CT Conversion Reagent和20微升的DNA样本，加入1.5毫升的离心管中。
混合。
2.准备好水浴锅，将离心管放入98℃水浴锅中10分钟，64℃水浴锅中2.5个小时。
（不能立即开始实验的，将样本放入4℃冰箱中，保存。
）3.将离心管中的溶液吸出，加入到Zymo-Spin TM的萃取柱中。
4.取600微升的M-Binding Buffer加入到萃取柱中，摇晃混匀。
5.转速＞10000转/分钟的离心机中，离心30秒。
倒掉液体。
6.取100微升的M-Wash Buffer加入萃取柱，离心30秒，倒掉液体。
7.取200微升的M-Desulphonation Buffer加入萃取柱，等待15~20分钟，使其充分浸润。
然后离心30秒。
8.取200微升的M--Wash Buffer加入离心管中，离心30秒。
重复此步骤一次，随后将收集柱丢弃，萃取柱放入1.5毫升离心管中。
9.取10微升的M-Elution Bufer加入到萃取柱中，离心30秒，萃取柱丢弃，离心管中得到处理好10微升DNA样本。
三．巢式PCR（体系，程序）第一轮PCR：模板（处理后的DNA），引物：MGMT--JF/R ，dd水，PCR MIX Golden Star。
体系为：20微升=模板DNA 4微升+引物2微升+dd水4微升+Golden Star 10微升（一管）反应条件：95℃ 10min95℃ 30s →52℃ 30s → 40个循环72℃ 30s →72℃ 10min4℃ forever第二轮PCR：模板（第一轮PCR的产物），引物：m-MGMT-F/R及u-MGMT-F/R，dd 水，PCR MIX Golden Star。
体系为：20微升=模板DNA 1微升+引物（m-MGMT-F/R）2微升+dd水7微升+Golden Star 10微升（一管）20微升=模板DNA 1微升+引物（u-MGMT-F/R） 2微升+dd水7微升+Golden Star 10微升（一管）反应条件：95℃ 10min95℃ 30s →64℃ 30s → 40个循环72℃ 30s →72℃ 10min4℃ forever四．PAGE电泳检测配置PAGE胶：12%的胶： 100ml 12ml30%丙烯酰胺： 40ml 4.8ml 10xTBE 10ml 1.2ml 10%过硫酸铵 0.7ml 84μl TEMED 35μl 4.2μl H2O 49.3ml 5.9ml。
MGMT-甲基化试剂盒研发 ppt课件
PPT课件
17
针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模 板检测应用甲基化检测探针检测其特异性
结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床
正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检
测信号。
PPT课件
甲基化水平的检出
检测流程的建立
分析性能评估
HANDS系统的引PP入T课件
检测体系建立
4
检测位点确定
• 通过文献调研确定MGMT基因启动子区域 • 甲基化CpG岛预测并与文献比较
ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7个潜在CpG位点
PPT课件
5
MGMT甲基化标准品构建
PPT课件
19
针对基因组DNA转化模板检测体 系少量临床样本检测
实验结果表明：目前体系可以对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT启动子的检测， 只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR
PPT课件
20
针对基因组DNA转化模板检测体系 灵敏度深入考察
8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍
400copies/ul
4 copies/ul 80 copies/ul 16 copies/ul
结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类 基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标 准品（50%甲基化参考品）
PPT课件
26
甲基化灵敏度
PPT课件
23
应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因 甲基化梯度参考品
MGMT甲基化调研报告
MGMT启动子甲基化调研1.研究发现，在脑胶质瘤、结直肠癌、肺癌、胃癌等肿瘤中均存在MGMT基因启动子甲基化[1-5]。
其中，以在脑胶质瘤中的研究最为广泛和深入。
脑胶质瘤中MGMT启动子甲基化的频率在半数以上，研究多围绕甲基化与替莫唑胺等药物治疗疗效的相关性展开[1-2, 6]。
2.药物应答方面：研究发现，MGMT启动子甲基化的脑胶质瘤患者经替莫唑胺治疗的生存期更长[1, 6]，但MGMT甲基化与PCV化疗（甲基苄肼+洛莫司汀+长春新碱）的疗效无关[7]。
还有研究显示，MGMT甲基化能够降低脑胶质瘤患者经替莫唑胺后的复发率，且能延长复发时间[8]。
3.生存方面：MGMT甲基化与脑胶质瘤患者无进展生存期和总生存期均呈正相关[7]。
4.2013版美国国家癌症综合网络（NCCN）临床治疗指南建议胶质母细胞瘤患者应行MGMT甲基化检测，对于甲基化阳性患者推荐使用替莫唑胺治疗。
参考文献1. Hegi, M.E., et al., MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. NEngl J Med, 2005. 352(10): p. 997-1003.2. Mollemann, M., et al., Frequent promoter hypermethylation and low expression of the MGMTgene in oligodendroglial tumors. Int J Cancer, 2005. 113(3): p. 379-85.3. Shen, L., et al., MGMT promoter methylation and field defect in sporadic colorectal cancer. JNatl Cancer Inst, 2005. 97(18): p. 1330-8.4. Brabender, J., et al., Quantitative O(6)-methylguanine DNA methyltransferase methylationanalysis in curatively resected non-small cell lung cancer: associations with clinical outcome.Clin Cancer Res, 2003. 9(1): p. 223-7.5. Park, T.J., et al., Methylation of O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase gene isassociated significantly with K-ras mutation, lymph node invasion, tumor staging, and disease free survival in patients with gastric carcinoma. Cancer, 2001. 92(11): p. 2760-8.6. Everhard, S., et al., MGMT methylation: a marker of response to temozolomide in low-gradegliomas. Ann Neurol, 2006. 60(6): p. 740-3.7. van den Bent, M.J., et al., MGMT promoter methylation is prognostic but not predictive foroutcome to adjuvant PCV chemotherapy in anaplastic oligodendroglial tumors: a report from EORTC Brain Tumor Group Study 26951. J Clin Oncol, 2009. 27(35): p. 5881-6.8. Brandes, A.A., et al., Recurrence pattern after temozolomide concomitant with and adjuvantto radiotherapy in newly diagnosed patients with glioblastoma: correlation With MGMT promoter methylation status. J Clin Oncol, 2009. 27(8): p. 1275-9.。
检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法[发明专利]
![检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7af783c55901020206409c19.png)
专利名称：检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法
专利类型：发明专利
发明人：刘晓峰,程宇,侯然,朱立文,梁超,王绪华,方国伟,黄士昂,陈忠
申请号：CN201310537612.X
申请日：20131104
公开号：CN103571958A
公开日：
20140212
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法，同时还公开了所述引物和试剂盒的应用。
本发明所公开的引物是根据人类MGMT基因启动子区域序列设计特异性引物，可使用包含有所述引物的试剂盒，通过巢式PCR扩增结合DHPLC（变性高效液相色谱分析）检测，快速、准确、高灵敏度地检测MGMT基因甲基化。
申请人：北京海思特临床检验所有限公司
地址：100017 北京市大兴区北京市亦庄经济技术开发区地盛北街1号A-3,A-4
国籍：CN
代理机构：北京天奇智新知识产权代理有限公司
代理人：陆军
更多信息请下载全文后查看。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
针对基因组DNA转化模板检测体系 灵敏度深入考察
8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍 实验结果表明：针对基因组DNA转化模板检测体系，可以检测到转化液稀释 512倍相当于基因组拷贝数12
质量控制体系的建立
参考品构建
98％转化液构建 由100％人类基因组转化液与人类基因 组按比例对参得到
非甲基化探针P 甲基化长探针M
完全转化且位 点完全甲基化
3
3
6copies/ul 12copies/ul
100copies/ul 50copies/ul 25copies/ul 实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板，灵敏度为可以为检测到 6copies/ul
针对基因组DNA转化模板检测体 系少量临床样本检测
实验结果表明：目前体系可以对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT启动子的检测， 只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR
针对基因组DNA转化模板检测体 系添加剂体系筛选
F1R2+PROBE2 F1R2+PROBE2+20um蔗糖 F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+
1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA
实验结果表明：在反应体系中不添加任何添加剂对检测的效果较好;
分析性能评估
1.特异性考察 2.梯度标准品验证 3.反应体系稳定性 4.灵敏度考察
人类MGMT基因（启动子） 甲基化检测(MSP法)试剂盒 研发项目分享
主讲人：刘骏珲 技术支持：刘旭宏
抑癌基因
它可以通过多种信号传导途径 以及蛋白-蛋白之间的相互影响起 作用，影响细胞生长、分化、转移 、粘连、增殖及细胞周期，促进凋 亡，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。
MGMT基因启动子
• 1.与癌症相关
OR
qPCR体系建立
三大体系
• G体系 针对人类基因组DNA设计 • P（非甲基化）体系 根据转化后序列（非CpG位点设计探针） • L（甲基化）体系 覆盖CpG位点（全甲基化）的长探针
引物探针设计
• HANDS系统引入
1.减少引物二聚体 2.增加结合效率 3.增加酶切活性 4.保护碱基
HANDS系统
400copies/ul
4 copies/ul 80 copies/ul 16 copies/ul
结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类 基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标 准品（50%甲基化参考品）
甲基化灵敏度
• 采用MGMT基因启动子50%的甲基化参考 品，按照比例依次稀释，依次构建
50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%
应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考 品对掺正常人类基因组转化液（按照400copies/ul6copies/ul每一个浓度都加上正常人类基因组转化液）
100copies/ul 200copies/ul 400copies/ul
6copies/ul 12copies/ul 25copies/ul 50copies/ul
实验结果表明：目前梯度稀释范围从2*1010copies/ul到2*103copies/ul，临床正常样本 转化液lCt值位于2*103copies/ul之后，需要进一步定量
应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯 度参考品并且对临床正常样本转化液进行进一步定量
临床正常样本转化液 2*103copies/ul
检测流程的建立
分析性能评估
HANDS系统的引入
检测体系建立
检测位点确定
• 通过文献调研确定MGMT基因启动子区域 • 甲基化CpG岛预测并与文献比较
ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7个潜在CpG位点
MGMT甲基化标准品构建
• • • • • 1.确定目标序列，设计引物 2.重叠延伸PCR制备DNA 3.菌液培养 4.浓度标定 5.测序验证
针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模 板检测应用甲基化检测探针检测其特异性
结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床 正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检 测信号。
应用甲基化检测探针检测其MGMT 基因甲基化梯度参考品
200copies/ul 400copies/ul
1：1甲基化参考品 由100％人类基因组转化液与甲基化质 粒标准品按比例对参得到
应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因 甲基化梯度参考品
2*107copies/ul-2*103copies/ul 结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释2*103copies/ul在Ct值上与400ng转化人类基 因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标准品
脑胶质癌
肠癌
MGMT基因启动子发生甲基化
口腔癌
肠癌
研发思路
MGMT甲基化检测试剂盒研发 引物的筛选 引物优化比例的确定 初步检测体系的建立 引物性能的评估
多因素优化设计
DNA质控体系建立，甲基化标准品合成
基因残留质控
转化成功质控
98%转化参考品构建
筛选合格样本
甲基化浓度梯度参考 品 甲基化水平的检出
应用转化液通检探针检测其MGMT 基因甲基化质粒梯度参考品并且对 临床正常样本转化液进行初步定量
2*108copies/ul 2*109copies/ul 2*1010copies/ul
临床正常样本转化液
2*107copies/ul
2*106copies/ul Nhomakorabea2*105copies/ul
2*103copies/ul
以上浓度梯度均加入2.5ng正常人类基因组转化液构成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%） 参考品 实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板灵敏度为2.4%
整体效果
质粒梯度不惨正常人类基因组转化液
只加正常人类基因 组转化液
NTC 质粒梯度对掺惨正常人类基因组转化 液
THANK YOU
DNA重亚硫酸盐转化体系确定
• 供应商选择 1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215) 2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒 3.EZ DNA Methylation™-GOLD Kit • 转化程序选择
1. 98°C for 10 minutes 2. 53°C for 30 minutes 3. 53°C for 6 minutes 4. 37°C for 30 minutes 5. 4°C storage（3-4步 8循环）
5 3
3
5
针对基因组DNA转化模板引物的筛选实验
F1R2 F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3 R2;F3R3;F4R2
实验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作 为检测引物
淬灭探针
• 甲基化长探针
FAM
BHQ
BHQ
针对基因组DNA转化模板探针以 及引物HAND的筛选实验
F1R2+POBE2 AT-F1 AT-R2+POBE2 AT-F1 AT-R2+PROBE1 F1R2+PROBE1
实验结果表明：AT-F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用 这对引物作为检测引物
反应体系优化
• 1.体系中Buffer，Mg2+,引物浓度等优化。
• 2.添加剂优化：蔗糖，NH4+, BSA