土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 课件
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(共20张PPT)
耐高温菌种提取耐高温酶。
启示： 根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找
（二）实验室中目的菌株筛选
原理 ： 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包
括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止
回答： 其他微生物生长。
1、在该配方中，为微生物生长提供碳 源和氮源的是什么物质？葡 只有萄能糖够、以尿尿素素
作为氮源的微生
C半固体培养基
D天然培养基
放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的 微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。
优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。 缺点：不能区分死菌和活菌；
难以计数微小的细菌。 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
2．间接计数法： 最常用稀释平板计数法。
原理： 1个活菌→1个菌落
统计原则 ①选 30~300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。
4、鉴定： 筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生 物的生存
酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解 成氨→培养基碱性增强→ 酚 红变红→脲酶阳性
五、实验过程注意
1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前 都要灭菌。
2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入 盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰 旁进行。
4）实验时要对培养皿作好标记。 注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当
事先规划时间。
六、结果分析与评价
注意：菌落计数偏差
1、统计的菌落数比活菌的实际数目 低 。这是因为当 两个或多个细胞在一起时，每平克板样上品中观的察菌到株的数只是 一个
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数_课件
实验组
尿素唯一氮源 牛肉膏蛋白胨
对照组
生长多种微生物
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微
生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数： 血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品 中微生物的数量。
2. 稀释涂布平板法 （活菌计数法） （1）原理：
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的 细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
/v_show/id_XMjY3NDM3 MTg0.html
/v_show/id_XMTc3Mjg3OTU2.html
NaH2PO4 MgSO4`7H2O 葡萄糖 尿素
1.4g
2.1g 0.2g 10.0g 1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看属于哪类？从功能上属于哪类培养基？
固体培养基
选择培养基 氮源：尿素
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素
4、怎样证明此培养基具有选择性呢？
培养基类型
结果
只生长分解尿素细菌
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件
培养基的种类情况
培养基
稀释倍数
103
104
105
106
平板1
242
210
202
102
选
择
平板2
250
240
86
98
培
养
平板3
310
250
198
120
基
平均数
162
106
牛肉膏蛋白胨 平板4
培养基
（对照）
菌落计数方法
例 不同浓度的平均菌落数
次 101
102
103
1 1365 164
20
2 2760 296
例：46（103）和296 （102）均在30～300之间，
则：46×103÷296×102≈1.6，
应取二者的平均值。
46×103÷296×102
(
0.1(ml)
) ÷2=3.775×105
3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释 度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。
培养基配方三
1.4g 0.2g
Na2HPO4 葡萄糖
1.0g
琼脂
2.1g 10.0g 15.0g
（一）筛选菌株——尿素细菌的分离
1.原理：根据某种微生物的特殊营养要求或其对物理、化 学因素（营养、温度、pH等）的抗性而设计的。
2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高 该菌的筛选效果。
3.方法：利用选择培养基来实现。
105
106
107
101
10g土壤
9ml
无菌水
9ml 无菌水
104
105
106
课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件
〔1〕土样不同 〔2〕培育基被杂菌污染 〔3〕混入了其他的含氮物质
如何确定缘由究竟是什么？
二.实验的详细操作
㈠土壤取样
从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去表层土3cm左
右，再取样，将样品装入事先预备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前
灭菌
都要 。
㈡制备培育基 制以备尿素为独一氮源 的选择培育基。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落 数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
本卷须知 ①为了保证结果准确，普通选择菌落数在30—3的00平板
上进展计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三 个以上的培育皿中，经涂布培育，计算出菌落平均数。
①从物理性质看此培育基属于哪类？ 固体培育基
㈡统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中 微生物的数量。
缺陷：
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需求相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以察看。
2.间接计数法〔活菌计数法〕 ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培育基上 所构成的一个菌落是由一个单细胞繁衍而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数
一、课题背景
1、尿素的利用：
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接 被之农 后作 才物 干吸被氨收植。物土利壤 用中 。的细菌将尿素分解成
2、细菌利用尿素的缘由：
脲酶
土3、壤反中响的式细：菌分解尿参素与是酚由红于指它示们剂能？合成 。
如何确定缘由究竟是什么？
二.实验的详细操作
㈠土壤取样
从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去表层土3cm左
右，再取样，将样品装入事先预备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前
灭菌
都要 。
㈡制备培育基 制以备尿素为独一氮源 的选择培育基。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落 数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
本卷须知 ①为了保证结果准确，普通选择菌落数在30—3的00平板
上进展计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三 个以上的培育皿中，经涂布培育，计算出菌落平均数。
①从物理性质看此培育基属于哪类？ 固体培育基
㈡统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中 微生物的数量。
缺陷：
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需求相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以察看。
2.间接计数法〔活菌计数法〕 ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培育基上 所构成的一个菌落是由一个单细胞繁衍而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数
一、课题背景
1、尿素的利用：
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接 被之农 后作 才物 干吸被氨收植。物土利壤 用中 。的细菌将尿素分解成
2、细菌利用尿素的缘由：
脲酶
土3、壤反中响的式细：菌分解尿参素与是酚由红于指它示们剂能？合成 。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数人教版选修PPT课件
课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
关于菌种的筛选和计数 1．菌株的筛选 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①根据它对___生__存__环__境___的要求到相应的环境中去寻找。 ②从土壤中分离出目的菌株。 (2)实验室目的菌株的筛选 原理：人为提供有利于___目__的___菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH 值等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
测定真菌：选用稀释 102、103、104倍
细菌：30～37 ℃；1～2 d 培养与观察 放线菌：25～28 ℃；5～7 d
真菌：25～28 ℃；3～4 d
计数
每克样品中的菌株数＝(C/V)×M， C——某一稀释液浓度下平板上生长的平均菌落数；
V——涂布平板所用稀释液体积(ml)；M——稀释倍数
5
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．关于选择培养基 (1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养 基。 (2)举例：以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离 到分解纤维素的微生物；缺氮培养基可以分离到固氮微生物等。
答案：A
12
分离能分解尿素的细菌
【例 2】选择土壤中分解尿素的微生物，所用氮源为( )
A．硝酸
B．氨
C．尿素
D．蛋白胨
【名师点拨】：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺
乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育
繁殖，从而受到抑制，所以，以尿素为唯一氮源的培养基能够
选择出分解尿素的微生物。
1
2．统计菌落数目的方法 (1)____直__接______计数法 ①过程：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在_显__微__镜___ 下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ②缺点：不能区分死菌和活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) 根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个 ___单__细__胞_____繁殖而成，按比例稀释样品后，将稀释液接种培 养，统计___菌__落___的数目。
关于菌种的筛选和计数 1．菌株的筛选 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①根据它对___生__存__环__境___的要求到相应的环境中去寻找。 ②从土壤中分离出目的菌株。 (2)实验室目的菌株的筛选 原理：人为提供有利于___目__的___菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH 值等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
测定真菌：选用稀释 102、103、104倍
细菌：30～37 ℃；1～2 d 培养与观察 放线菌：25～28 ℃；5～7 d
真菌：25～28 ℃；3～4 d
计数
每克样品中的菌株数＝(C/V)×M， C——某一稀释液浓度下平板上生长的平均菌落数；
V——涂布平板所用稀释液体积(ml)；M——稀释倍数
5
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．关于选择培养基 (1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养 基。 (2)举例：以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离 到分解纤维素的微生物；缺氮培养基可以分离到固氮微生物等。
答案：A
12
分离能分解尿素的细菌
【例 2】选择土壤中分解尿素的微生物，所用氮源为( )
A．硝酸
B．氨
C．尿素
D．蛋白胨
【名师点拨】：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺
乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育
繁殖，从而受到抑制，所以，以尿素为唯一氮源的培养基能够
选择出分解尿素的微生物。
1
2．统计菌落数目的方法 (1)____直__接______计数法 ①过程：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在_显__微__镜___ 下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ②缺点：不能区分死菌和活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) 根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个 ___单__细__胞_____繁殖而成，按比例稀释样品后，将稀释液接种培 养，统计___菌__落___的数目。
土壤中分解尿素的细菌分离和计数ppt课件
A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B 先铲去表层土3-8cm左右，再取样 C 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌 D 应在火焰旁称取土壤
2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列
正确的是 ①土壤取样
C
②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1ml进行平板涂布
④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度
不正确的是（D）
A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板 B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板 C 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48h D 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。
15
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中， 从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别 得到以下两种统计结果。
稀释倍数： 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液
测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液
思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？
土壤中各类微生物的数量不同
如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围
可以放宽103-107.
20
1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（ C ）
是
。
(3)示意图A和B中,
表示的是用稀释涂布平
板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部
分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振
荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因
是：振荡培养能提高培养液中
的含量，同时可
2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列
正确的是 ①土壤取样
C
②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1ml进行平板涂布
④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度
不正确的是（D）
A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板 B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板 C 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48h D 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。
15
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中， 从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别 得到以下两种统计结果。
稀释倍数： 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液
测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液
思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？
土壤中各类微生物的数量不同
如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围
可以放宽103-107.
20
1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（ C ）
是
。
(3)示意图A和B中,
表示的是用稀释涂布平
板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部
分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振
荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因
是：振荡培养能提高培养液中
的含量，同时可
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(共63张PPT)
跟踪练习 1. 分析下列培养基配方，回答有关问题。 MgSO4 KH2PO · 青霉素 琼脂 蒸馏水 FeSO4 NaNO3 成分 葡萄糖 4 7H2O 0.1万 1g 0.01 g 3g 0.5 g 15 g 1L 含量 30 g 单位 (1)根据物理性质，该培养基属于________ 固体 培养基；根据用途划 选择 培养基。根据培养基成分，所培养微生物的同化 分，则属于________ 作用的类型是________ 异养 。 (2)不论何种培养基，在各种成分溶化后，分装前，要进行的是 ________________ 。 调节pH
2．结果分析与评价 (1)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成 了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH 升高。因此，我们可以通过检测 培养基 pH 的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细 菌后，如果该细菌能够分解尿素，则 p严格厌氧型：短时 间的有氧也会造成 生长停滞或死亡， 如某些甲烷杆菌兼 性厌氧型：无氧时 进行无氧呼吸，有 氧时进行有氧呼 吸，如酵母菌一般 厌氧型：有、无氧 都进行无氧呼吸， 如某些链球菌
典例精析 (多选)依据不同的划分标准，培养基的类型不同，作用也不 同。下表中划分培养基的依据和培养基的类型及作用，正确的匹配是 ( ) 为了筛选土壤中能够降解某除草剂的细菌(目的菌)。有人做了如下图 实验：
3．对分解尿素细菌的鉴定 (1)原理 脲酶 CO2＋2NH3 CO(NH2)2＋H2O――→ 可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)方法 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细 菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
许多细菌如变形杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌，可将尿中的尿素分 解成氨，其代谢类型大都属于异养厌氧型； 大肠杆菌可将大便中的尿素分解成氨，其代谢类型属于异养、兼 性厌氧型。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数课件
答案：A
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是 A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。
一是由于土样不同；
二是由于培养基污染（混入其他N源）或操作失误。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
01
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
01
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
标准
培养基类型
配制特点
主要应用
物理性质
固体培养基
加入琼脂较多
微生物的分离、计数等
半固体培养基
加入琼脂较少
观察微生物运动、鉴定菌种、保藏菌种等
液体培养基
不加入琼脂
工业生产，连续培养
化学组成
合成培养基
由已知成分配制而成， 培养基成分明确
菌种分类、鉴定
天然培养基
由天然成分配制而成， 培养基成分不明确
工业生产
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是 A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。
一是由于土样不同；
二是由于培养基污染（混入其他N源）或操作失误。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
01
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
01
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
标准
培养基类型
配制特点
主要应用
物理性质
固体培养基
加入琼脂较多
微生物的分离、计数等
半固体培养基
加入琼脂较少
观察微生物运动、鉴定菌种、保藏菌种等
液体培养基
不加入琼脂
工业生产，连续培养
化学组成
合成培养基
由已知成分配制而成， 培养基成分明确
菌种分类、鉴定
天然培养基
由天然成分配制而成， 培养基成分不明确
工业生产
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
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2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生 物生长。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包 括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法： ⑴抑制大多数微生物生长 ⑵造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀 释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在50个左右为最好。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：稀释涂布平板法。
当样品的稀释度足够高时，培养基表 （2）原理：
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内 斗争最显著最激烈的时期是 答案：C A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物 对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时 候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加， 每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体 对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。 由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数 目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产 物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环 境的斗争。
A同学的结果与其他同学不同，可能 的解释有两种。 一是由于土样不同；
二是由于培养基污染或操作失误。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。
选择培养基：在微生物学中，将允
许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻 止其他种类微生物生长的培养基。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感 染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业 经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意 义。 ⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型 是 异养需氧型 ，青霉素是青霉菌的 次级 代谢产物。 ⑵在生产和科研中，常选用处于 对数 期的青霉菌作 为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 个体的形态 生理特性 比较稳定。 ⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发 酵液，经离心分离、反复洗涤 后， 称菌体的湿重 （称烘干后的重量） ，再计算发酵罐 中菌体的总重量。
4.下列说法不正确的是（ B ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。
四、操作提示
无菌操作 做好标记 规划时间
五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH 升高，指示剂将变红，说明该细菌能够 分解尿素。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水 用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养 基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出 水样中大肠杆菌的数量。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用
前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
实践训练
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ A ） A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ C ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) D A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
一、课题背景
1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 +H2O
脲酶 NH3 + CO2
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
六、例题解析
答案：A
例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌 C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。 这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时 测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测 定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长； 恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过 样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能 测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4`7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
㈠.筛选菌株
1、实例： DNA多聚酶链式反应是 一种在体外将少量DNA 大量复制的技术，此项 技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大 多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。
㈤.微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相 差悬殊，如相差较大，度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数 的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素 的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数 约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。