筛选标记和目的基因

8.色氨酸合酶 beta1(TSB1) 色氨酸(Trp)是一种存在于植物中的必 需氨基酸， 它不能在动物中合成。通常状态下植物并不合成 Trp， 只有处于伤害环境等胁迫条件下才诱导合成 Trp。 在植物中， AtTSB1 基因的主要作用是将吲哚和丝氨酸转变成为 Trp。目前， Hsiao 等研究发现 AtTSB1 基因在植物转基因中可以作为一种新颖的 非抗生素筛选标记， 对 5- 甲基色氨酸(5MT)或重金属的选择既简便 又快捷。在含有 75μM 5MT 或者300 μM CdCl 2 的 MS 培养基上筛选 转化植株效果很明显。通过以上研究结果得出结论， AtTSB1 转基因 植物中积累Trp 可以限制 Cd 2 + 和其他重金属的增加， 或者抑制金 属转运物的活动。因此， 重要的禾本科作物应用 AtTSB1 基因作为 筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金属污染的 土壤中。
4. α- 微管蛋白基因 从牛筋草中分离得到的 α － 微管蛋白基因突变 体对二硝基苯胺类除草剂(TFL)具有抗性。目前， 已经作为筛选标记 基因应用于单子叶植物和双子叶植物遗传转化研究工作中。
5.磷酸甘露糖异构酶(PMI)(manA) 编码 PMI 的 manA基因最初是从 大肠杆菌中分离提取出来的， 目前在酵母、动物及人体中都已分离 得到编码该蛋白的基因。然而， 除肉桂和一些豆类外， 自然界的 植物中大都没有编码 PMI 的基因， 因此以甘露糖为筛选剂的筛选体 系在绝大多数植物的遗传转化中都可以应用。并且被证明对环境和 人体健康都十分安全。但是容易受到培养基或外植体内其他糖类水 平等生理因素的干扰，因此该筛选体系的完善还有待进一步的研究。
筛选标记与目的基因
杨旭 160919012
筛选标记基因是一种已知功能或已知序列的基因， 能够起着特异性标记的作用。 在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要 标记，通常用来检验转化成功与否 筛选标记基因在遗传转化中担负着区分转化体和 非转化体的重要作用。 合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是转基因 成功的关键。
2.3 报告基因在微生物学研究中的应用 生物环境工程研究的重要工具. 微生物环境工程研究中使用的报告 基因有对有毒化学物质苯喃 （Benzofurans ） 响应的 SOS 细胞分离 抑制基因 ，钴离子诱导的半乳糖苷酶基因和钙离子调节的荧光素酶 基因等。操纵子参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫氧化代谢过程，并通 过特异性调控蛋白对底物 Na 2 S 2 O 3 的诱导作用产生响应 . 作为一 种简便有效的方法，报告基因在微生物检测和调控研究中正发挥着 越来越重要的作用.
9.氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA) 双子叶植物叶绿体转化多采 用 aadA 基因， 用壮观霉素(spectinomycin)进行筛选， 获得同质叶 绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大， 分化植株的前期 筛选一般 2 ～8 个月， 甜菜叶绿体转化筛选8 个月后才分化植株 。 棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植 株则长达 18 个月 。单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性， 因此， 水稻叶绿体转化时 aadA 基因的筛选采用链霉素， 链霉素的 作用机理主要抑制非转化细胞分化绿苗和根的形成， 愈伤组织阶段 筛选效果很不明显， 后期分化绿苗以及生根阶段效果才体现出来， 其作为禾本科作物的筛选标记， 效果并不理想。
1.4 荧光蛋白基因 荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质
量为 20~30 kD 的同源性蛋白，包括绿色、 红色、 黄色和青色荧光 蛋白等。 绿色荧光蛋白 （GFP ） 是其中应用的最多的一种，最初 是从维多利亚发光水母 （Aequorea victoria ） 中分离得到. 下村修 在研究水母的发光机制时发现腔肠素 （coalenterazine ） 和钙离子 与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激发 GFP， 使其发绿色荧光GFP 是一条由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白，相 对分子质量为 27kD，用 395 nm 的紫外光和 475 nm 的蓝光激发， 可在 508 nm 处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物.
3.草丁膦 N －乙酰转移酶(PAT)(bar) 编码 PAT 的 bar基因最初是从 吸水链霉菌中分离出来的。PAT 能使草丁膦的自由氨基乙酰化， 从 而使草丁膦对植物无毒害作用。 这种筛选体系具有快速简便、 高效， 细胞产生的假转化体少， 并 且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点。它是目前用得最多 的选择标记基因之一。
1.新霉素磷酸转移酶 II(NPT II)(npt II) nptⅡ基因最初是从大肠杆菌 转座子 Tn5 中分离得到的， 即氨基糖苷磷酸转移酶 Ⅱ 基因， 它编 码的氨基糖苷磷酸转移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此 nptⅡ基 因作为筛选标记基因可以使转化细胞对抗生素如卡那霉素、 G418、 巴龙霉素、 新霉素等产生抗性， 进而达到筛选的效果。目前， 该 基因仍是植物基因工程中运用很广泛的选择标记基因。 2.潮霉素磷酸转移酶(HPT)(hpt) 从大肠杆菌中分离出来的 hpt 基因 可以编码 HPT， 使其具有潮霉素 B的抗性。hpt 基因被证明是单子 叶植物较为理想的筛选基因，因其选择效率高、 基因型差异小、 对转化细胞不产生或很少产生毒害作用、 再生的转基因植株育性较 好等优点在水稻、玉米和小麦等作物上得到了广泛应用。目前， 大 多数转基因水稻的有关研究中， 均以 HPT 作为抗性选择标记。
GFP 相对分子质量小、 荧光稳定、 对活细胞无害、 检测方法容 易 ，还可以用流式细胞仪对悬浮细胞进行高灵敏度和特异性检测， 加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶等作用均不能使它灭活. GFP 的上述诸多优点已使其成为众多报告基因中的后起之秀，被称为 “活细胞的分子探针” . 然而，GFP 在某些特定的细胞中不表达， 因此在实验前需要进行目的细胞和检测手段的初选 . 此外，由于野 生型 GFP 无放大作用，因此它比荧光素酶灵敏度低. 自从 1991 年 GFP 基因克隆以来，已经有多种 GFP 突变体问世，有蓝绿色荧光蛋 白 （CFP ） 、 黄色荧光蛋白 （YFP ） 和蓝色荧光蛋白 （BFP ） ， 它们都显现出优于野生型 GFP 的特性
1.3 荧光素酶基因（Luc ） 荧光素酶 是指能催化不同底物 （如荧光素、 腔肠素等） 发生氧化 使其发射出荧光的一类酶的总称。 目前最常用的荧光素酶有细菌荧 光素酶 （BL ） 和萤火虫荧光素酶 （FL ） 两大类。FL 的检测线性范 围宽达 7～8 个数量级，检测灵敏度可达 10 -19 mol（比 CAT 高 100 倍） ，现已成为哺乳细胞中的最常使用的报告基因. 高灵敏度、 多 用途、 半衰期短、 背景极低和相对简单的分析方法是萤火虫荧光 蛋白流行使用的主要原因. 常用的检测荧光素酶的方法有液闪法和 光照度计法. 随着具有膜透过性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的 发现和使用，无需裂解细胞即可检测酶的活性.
2 报告基因的应用
报告基因能实时定量检测细胞活动和生理化学物质的变化情况，并 且具有实时性、 非侵入性、可靠性、 易检测、 可重复性、 高敏感 性、 可用于大规模检测等优点，因此在植物基因工程、动物基因表 达调控、 分子显影影像学、 启动子活性分析、 基因转移分析、 信 号转导通路研究、 受体功能鉴定、细胞毒性检测、 生物大分子的 相互作用、 药物开发的生物筛选等诸多领域都有广泛的应用.
1.2 β- 半乳糖苷酶基因（β-galactosidase ） β-半乳糖苷酶 是大肠杆菌乳糖操纵子中 lacZ 基因的产物，在遗
传学、 细胞生物学和分子生物学研究中广泛应用于监测和校正转染 效率 . β-半乳糖苷酶能催化包括乳糖在内的各种半乳糖苷的水解. 大 肠杆菌β-半乳糖苷酶比较稳定，易于检测且无需放射性元素，相对 于CAT 有更好的优越性. β-半乳糖苷酶根据所使用的不同底物的情况， 浓度低至 1 amol 都可以被检测出。
6.木糖异构酶(xylA) xylA 基因是由赤褐色链球菌和嗜热厌氧杆菌中 分离出来的。木糖是半纤维素的主要组成部分， 是生物体内含量仅 次于葡萄糖的糖类。同甘露糖一样， 木糖也是许多植物细胞不能代 谢利用的糖类， 例如烟草、马铃薯和番茄不能用 D- 木糖作为唯一 碳源。然而木糖异构酶(D- sylose ketol- isomerse)可以催化木糖成为 D- 木酮糖， D-木酮糖可作为碳源。这种筛选方法比 nptII 基因的筛 选效率高 10 倍左右， 并且发芽更快。研究证明这种酶是生物安全 的并且在食品工业中得到普遍应用。
2.1 报告基因在植物学研究中的应用 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要是抗菌素抗性基 因和编码催化人工底物形成荧光物质的酶基因。 前者常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因 （CAT ） 、 新霉素 磷酸转移酶Ⅱ基因 （NPT Ⅱ） 、 潮霉素磷酸转移酶基因 （HPT ） 以及庆大霉素转移基因等，后者则包括 β-葡糖醛苷酶基因 （GUS ） 、 萤火虫荧光素酶基因 （Luc ） 和绿色荧光蛋白基因 （GFP ） 等。 新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因 （NPT Ⅱ ） 来自大肠杆菌 aphA2 基因， 是目前在植物基因转化中应用最广泛的选择标记基因
1 报告基因的类型和特点
1.1 氯霉素乙酰转移酶基因（ CAT ） 氯霉素乙酰转移酶 基因最早应用于检测哺乳动物中的基因表达. 作 为报告基因，氯霉素乙酰转移酶基因表达产物比较稳定，且在活性 很低的水平就能被检测出来. CAT 能催化氯霉素乙酰化反应，将乙酰 基从乙酰辅酶 A 转移到氯霉素的 3-羟基位上，再通过测量放射性标 记的底物实现量化 . CAT 在真核细胞中的本底很低，结果重现性好 且灵敏度高，是真核基因表达调控研究中最早使用的报告基因之一. 然而，由于依赖放射性元素，存在对操作者和环境的安全性问题， 因此其应用前景受到了一定的限制. 与之类似的报告基因有潮霉素 磷酸转移酶 （HPT ） ，β-葡 糖 醛苷酶基因 （GUS ） 等.
2.2 报告基因在动物学研究中的应用 在动物基因表达调控的研究中因、 二氢叶酸还原酶基因、 荧光酶基因等. 目前应用较多的是 GFP 的突变体—— — 增强型绿色 荧光蛋白 （eGFP ） ，发射出的荧光强度比GFP 强 4～35 倍，因此， 比 GFP 更适合作为一种报告基因来研究基因表达、 调控、 细胞分 化及蛋白质在生物体内定位和转运等。 荧光素酶基因可用于标记基因、细胞和活体动物.