重组抗HER2ScFv_FDT_caspase_6基因的构建_表达及其活性鉴定
FHIT和P16蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义
【 摘 要】目的 研 究 Ｆ ＨＩ Ｔ和 Ｐ １ ６基 因 蛋 白在 非 小 细胞 肺 癌 （ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ） 中的表 达 及 其 意 义 。 方 法 使 用组 织芯 片 和 免 疫 组织 化 学 ｓ Ｐ法 检测 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ和 Ｐ １ ６基 因蛋 白在 ６ ０例 非 小细 胞 肺 癌 组织 中 的表 达 情 况 。 结 果 非 小 细胞 肺 癌中 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ和 Ｐ １ ６蛋 白表达 阳性 率 差异 无 统计 学 意义 （ Ｐ＞０ ． ０ ５ ） 。 Ｆ ＨＩ Ｔ的表达 阳性 率 在肺 鳞 癌 中为 ３ ７ ． ９ ３ ％（ １ １ ／ ２ ９ ） ，在肺 腺 癌 中 为 ７ ０ ． ９ ６ ％（ ２ ２ ／ ３ １ ） （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ； Ｐ １ ６的表 达 阳性 率 在肺 鳞 癌 中为 ３ １ ． ０ ３ ％（ ９ ／ ２ ９ ） ，在 肺 腺 癌 中为 ７ ０ ． ９ ６ ％（ ２ ２ ／ ３ １ ） （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） 。Ｆ ＨＩ Ｔ蛋 白表 达 与肺 癌淋 巴结转 移有 关 （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） 。 结论 尚不 能认 为 非小 细 胞肺 癌 中Ｆ ＨＩ Ｔ和 Ｐ １ ６蛋 白表达 相 互关 联 。Ｆ ＨＩ Ｔ和 Ｐ １ ６在肺 鳞 癌 发 生 中起 了重 大 作 用 。 Ｆ ＨＩ Ｔ可 作 为预 测非 小 细胞 肺 癌有 无 淋 巴结 转移 的指标 。 【 关键 词１ 非 小 细胞 肺癌 ； Ｆ ＨＩ Ｔ； Ｐ １ ６ ； 免 疫组 织化 学 ； 组 织芯 片
抗体制备技术的发展和医学应用
抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。
它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。
国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。
抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。
多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。
因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。
1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
基因工程抗体
基因工程抗体[摘要]抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
关键词: 基因工程抗体；抗体基因工程抗体,即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中,在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。
一、基因工程抗体概述基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。
此技术的基本原理是[1],首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA,逆转录成cDNA,再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因,按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中,并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子,筛选出高表达的细胞株,再用亲和层析等手段纯化抗体片段。
基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分,保留原有抗体的亲和力和特异性。
借助于基因工程技术,既可以对完整抗体,又可以对抗体片段进行改造。
二、基因工程抗体类型1.重组抗体片段小分子抗体以表达抗体轻重链可变区基因为主,含或不含外源肽链的分子较小的抗体片段,以分子小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。
主要包括单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体、抗体Fab段、单域抗体(single domain antibody,SDA)、三链抗体(triabody)、抗体F(ab')2等。
目前研究较多的是单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体和抗体Fab段。
1.1单链抗体单链抗体单链抗体是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,是保持了亲本抗体的抗原性和特异性的最小功能型抗体片段,具有分子小、免疫原性低、无Fc端、不易与具有Fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强等特点,可作为将药物、毒素、放射性核素、细胞因子导向肿瘤的有价值分子;还可以将单链抗体基因导向到肿瘤细胞,在肿瘤细胞中表达,干扰肿瘤细胞蛋白表达,这种抗体称为胞内抗体。
抗表皮生长因子受体的单链抗体ER(Fv)的构建及其抗肿瘤活性
抗表皮生长因子受体的单链抗体 ER（ Fv） 的构建及其抗肿瘤活性研究
盛唯瑾，尚伯杨，苗庆芳，甄永苏* （ 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 100050）
摘要： 目的 利用大肠杆菌表达抗表皮生长因子受体（ EGFR） 的单链抗体并对其抗肿瘤活性进行研究。方法 构建含有抗
43. 9% 、46. 7% 和 54. 8% ，与对照组相比存在显著差异。结论 成功地表达了抗 EGFR 单链抗体 ER（ Fv） ，其对肿瘤细胞具有
良好的亲和力和一定的生长抑制作用，为研制靶向 EGFR 的抗体药物提供基础。
关键词： 表皮生长因子受体； 单链抗体； 抗肿瘤
中图分类号： R293
文献标志码： A
Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）
ABSTRACT： OBJECTIVE To express single-chain Fv （ scFv） antibody against epidermal growth factor receptor （ EGFR） with Escherichia coli，and study its antitumor activity. METHODS Recombinant plasmids containing scFv gene fragment were constructed and transformed into competent E. coli BL21（ DE3） starTM. The scFv antibody，ER（ Fv） ，was produced after IPTG induction，and then purified with Ni ion affinity chromatography. ELISA was used for measuring the binding efficiency of ER（ Fv） to EGFR，and flow cytometry was applied to assay the binding activity between ER（ Fv-LDP） and tumor cells. The cytotoxicity of ER（ Fv） against tumor cells in vitro was assessed by MTT assay，and the tumor inhibitory effect in vivo was observed in nude mice bearing human epidermoid carcinoma A431 xenograft. RESULTS ER（ Fv） with His-tag was produced in the form of inclusion bodies，and was purified with Ni ion affinity chromatography. Finally 10 mg of purified protein were obtained from 1 L of culture medium. ER（ Fv） possessed powerful
重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化
重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【摘要】旨在优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的自诱导培养基,以提高菌体产量及可溶性的重组rHAP蛋白含量.选取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素,各取4个水平,采用正交表L16(45)进行试验设计,时影响菌体生长和可溶性rHAP表达水平的乳糖浓度进行了优化.结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比:2％蛋白胨,1.5％酵母,0.5％甘油,0.03％葡萄糖,0.2％乳糖.此时表达菌密度OD600和可溶性rHAP目标蛋白表达量分别是未优化前的2.04倍和2.85倍.在20 L发酵表达时,rHAP工程菌OD600值高迭93,菌体温量为1 620 g/20L.利用Q-Sepharose和SP-Sepharose纯化,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】7页(P192-198)【关键词】抗血栓蛋白;优化培养;发酵;纯化;鉴定【作者】龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【作者单位】常州大学石油化工学院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州大学石油化工学院,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164【正文语种】中文重组人抗血栓蛋白（rHAP）[1]正是利用蛋白质工程和基因工程技术，将人胎盘抗凝蛋白与水蛭素C端结构域结合在一起的一种新的抗凝蛋白，分子量大小约为38 kD。
初步研究表明，重组人胎盘抗凝蛋白变体保留了Annexin V和血小板结合的性质，同时又具有明显的凝血酶抑制活性，而且其凝血酶抑制活性具有明显的剂量依赖关系[2]。
FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测
FANCJ在HEK293T细胞中的表达、纯化及活性检测袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【摘要】目的构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t 基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt 与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)036【总页数】4页(P4584-4587)【关键词】FANCJ;突变体;蛋白纯化;活性检测【作者】袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【作者单位】苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006【正文语种】中文【中图分类】Q814.1FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因编码的蛋白是第1个被确认的同乳腺癌相关肿瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相结合的蛋白，因此其最初被命名为BRCA1结合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；随后又被命名为BRCA1相互影响的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有类似名称的转录因子相混淆；而近年来该蛋白被发现是范可尼贫血(fanconi anemia，FA)通路的成员之一，故被称为FANCJ蛋白[1-3]。
Adeno-X 表达系统----最有效的腺病毒系统之一 --生物通
Viral DNAPlasmid-based
制备穿梭载体和腺病毒载体7-14天7-14天2-3天
目的基因从穿梭载体克隆到腺病毒载体--0-15天4天
获得重组腺病毒14-21天17-22天4-7天
内部结构可控的大体积三维细胞支架制备研究 得票数：125 [投本文一票]
2006.2 Vol 26, No.2--
人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究 得票数：284 [投本文一法减少了非重组腺病毒的产生，且无需进行费时的噬斑纯化。由于SwaⅠ消化可以消除由非线性的Adeno-X病毒DNA引起的背景，因此大多数的转化克隆含有重组腺病毒DNA。
重组腺病毒感染许多人细胞类型
噬斑纯化5-10天0-5天--
总计26-45天24-56天10-17天
以体外连接方法为基础 (by
Mizuguchi和Kay)，CLONTECH的Adeno-X™表达系统提供了一种快速、高效构建重组腺病毒的方法。只需4至7天就可以获得重组腺病毒，如图1所示。由于经过7天的培养之后HEK
293病毒包装细胞系。由于从Adeno-X病毒DNA中删除了E1基因，使其无法感染细胞，这一步需要用HEK
293包装细胞提供反式的E1蛋白，即可得到含有目的基因、有感染能力的重组腺病毒。
高效感染
【浙江省自然科学基金】_蛋白纯化_期刊发文热词逐年推荐_20140812
科研热词 推荐指数 链亲和素 2 融合蛋白 2 白细胞介素15 2 抗体 2 鲈 1 锚定文献标识码]a 1 酶解 1 过氧化物酶体增殖剂激活受体γ 1 赤魟 1 表位 1 膜联蛋白a2 1 细胞毒t细胞 1 组织表达 1 组织分布 1 纳米硅胶 1 牛血清蛋白 1 灰飞虱 1 沙眼衣原体 1 水稻条纹叶枯病毒 1 槲皮素 1 木瓜蛋白酶 1 抗独特型 1 抗氧化肽 1 实验性变态反应性脑脊髓炎 1 外膜蛋白ompu 1 哈维氏弧菌 1 吸附 1 同位素标记 1 原核表达 1 单核细胞 1 单克隆抗体 1 凝血致活酶 1 免疫原性 1 克隆 1 人乳头瘤病毒 1 亚细胞定位 1 主要外膜蛋白 1 中试工艺 1 β 2糖蛋白ⅰ 1 shp-2 1 sh2结构域 1 rna干扰 1 mog 1 hsqc 1 elisa 1 cd4+cd25+调节性t细胞 1 bm595 1 aqp-4 1
科研热词 推荐指数 原核表达 3 创伤弧菌溶细胞素 3 溶血活性 2 溶细胞素 2 应激因子 2 创伤弧菌 2 鸡胚 1 阻断作用 1 鉴定 1 重组,遗传 1 质粒 1 表达 1 表皮生长因子受体 1 融合蛋白 1 蝎毒活性肽 1 蜂毒溶血肽 1 膜毒性免疫毒素 1 耐药机制 1 结核分枝杆菌 1 细胞毒性 1 细胞凋亡 1 纯化 1 睾丸 1 癌胚抗原 1 流式细胞术 1 气味结合蛋白 1 支持细胞 1 捻转血矛纯虫 1 抗肿瘤缬精甘肽 1 抗原,cd14/免疫学 1 抗体,单克隆 1 工蜂触角 1 大肠杆菌表达 1 大肠杆菌 1 多克隆抗体 1 基因表达 1 噬菌体展示 1 可溶性表达 1 原核细胞 1 包涵体 1 分泌排泄 1 免疫诊断 1 保护作用 1 人线粒体色氨酰-trna合成酶 1 人ecv304细胞 1 亲和纯化 1 亚细胞定位 1 乳头状瘤病毒 1 中华蜜蜂 1 东亚钳蝎 1 t细胞表位 1 t淋巴细胞 1
Her-2、Ki-67在胃癌中的表达及其临床意义
Her-2、Ki-67在胃癌中的表达及其临床意义刘立新;张智;刘春华;李树斌【摘要】目的检测Her-2、Ki-67在胃癌中的表达及与临床病理的相关性。
方法检测55例胃癌术后标本中Her-2、Ki-67的表达,结合病理及随访综合分析。
结果全组Her-2表达阳性者24例（43.6%）,Ki-67表达阳性40例（72.7%）,经χ~2检验,两组阳性表达在不同病理类型中无差别（P〉0.05）。
Her-2的阳性表达,在浸润的深度、淋巴结转移和临床分期中,经χ~2检验,均有差异性（P〈0.05）。
Ki-67表达在后两者中有明显差别（P〈0.05）。
全组20例（36.4%）同时表达Her-2和Ki67,经Spearman分析,有高度相关性（P〈0.05）。
Her-2表达阳性的无病生存期及中位生存期,经Kaplan-Meier分析均低于表达阴性者（P〈0.05）。
结论 Her-2、Ki-67表达与胃癌生物学行为密切相关,对胃癌预后评估及其治疗的选择有一定指导意义。
【期刊名称】《白求恩医学杂志》【年(卷),期】2017(015)005【总页数】3页(P572-574)【关键词】胃肿瘤受体,Her-2 Ki-67 预后【作者】刘立新;张智;刘春华;李树斌【作者单位】[1]江苏省宝应县人民医院消化内科,225800;[2]江苏省宝应县人民医院肿瘤内科,225800;[3]江苏省宝应县人民医院病理科,225800【正文语种】中文【中图分类】R735.2Her-2 作为胃癌发生的重要因素，已成为一种新的基因治疗靶点，同时Ki-67 已被认为是一种评估性的肿瘤细胞增殖活性现象，其在恶性潜能中存在复发预测的可靠性的指标资源[1]。
通过研究，发现了Her-2、 Ki-67在胃癌中所呈现的具体表达状况，这种症状与病理无明显的关联性，需要通过对生物学行为、预后相关性等问题的分析，构建科学化的治疗方式，并通过创新方式的探究，在临床医学中进行推广。
成纤维细胞活化蛋白抑制剂在肿瘤诊疗中的研究进展
成纤维细胞活化蛋白抑制剂在肿瘤诊疗中的研究进展作者：叶雨萌，周学素，田启威，薛峰峰，杨仕平来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2022年第04期摘要：成纤维细胞活化蛋白（FAP）在90%以上的上皮性癌间质中高表达，可以作为肿瘤成像和治疗的靶点.而一些已开发的成纤维细胞活化蛋白抑制剂（FAPI），由于对肿瘤的高亲和力和高肿瘤积聚，对肿瘤的诊断和治疗具有重大意义.文章综述了近年来FAPI在肿瘤诊疗方面的研究进展，重点阐述了新型FAPI在核医学上的诊疗应用，并且从构效关系上讨论了FAPI的靶向弹头结构，增强FAPI选择性及延长肿瘤保留时间的策略，进一步推动了FAPI向临床诊疗试剂转化.关键词：成纤维细胞活化蛋白抑制剂（FAPI）; 核医学影像; 放射性治疗; 构效关系中图分类号： R 817.9 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2022）04-0436-07Progress in fibroblast activation protein inhibitors for cancer diagnosis and treatmentYE Yumeng1， ZHOU Xuesu1， TIAN Qiwei1，2， XUE Fengfeng2， YANG Shiping1*（1. College of Chemistry and Materials Science， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China; 2. Shanghai Key Laboratory of Molecular Imaging， Shanghai University of Medicine and Health Sciences， Shanghai 201318， China）Abstract： Fibroblast activation protein（FAP） is highly expressed in more than 90% of epithelial carcinoma stroma and can be used as a target for tumor imaging and therapy. Some developed FAP inhibitors（FAPI） are of great significance in the diagnosis and treatment of tumors due to their high affinity for tumors and high tumor accumulation. Herein，the research progress of FAPI in tumor diagnosis and treatment in recent years was reviewed，with an emphasis on the clinical application of novel FAPI in nuclear medicine. In addition，FAPI targeting warhead structure and the strategies of enhancing FAPI selectivity and prolonging tumor retention time were discussed from the perspective of structure-activity relationship，which further promoted the transformation of FAPI into clinical diagnosis and treatment reagents.Key words： fibroblast activating protein inhibitors（FAPI）; nuclear medical imaging; radiation therapy; structure-activity relationship0 引言癌相关成纤维细胞（CAFs）是一种异质性的成纤维细胞样细胞群，在肿瘤生长、迁移、转移、重构细胞外基质、治疗抵抗和免疫抑制中发挥关键作用，同时也是肿瘤微环境结构中最丰富的一类细胞[1-2].与癌细胞相比，CAFs的基因更稳定，更不易发生治疗耐药性[3-4]，是癌症诊断和治疗的理想靶细胞.成纤维细胞活化蛋白（FAP）是一种II型膜结合的丝氨酸蛋白酶[5]，在CAFs中过表达，而在健康成人组织中很少表达[6].有数据统计，FAP在90%以上的上皮性癌的间质中过表达[4].而且，在直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，FAP的高表达与肿瘤局部浸润增加、淋巴结转移风险增加和患者生存期下降有关[7].从FAP与肿瘤组织的相关性、调节肿瘤行为的有效性可见，FAP是一个肿瘤靶向诊疗的理想靶点.因此，根据FAP在CAFs中的高表达及自身的蛋白酶特性，研究者们已经开发了一系列成纤维细胞活化蛋白抑制剂（FAPI）.FAPI能够选择性地富集在肿瘤组织中，是一种有效的肿瘤靶向试剂，并且结合各种放射性同位素，展现出应用于癌症诊疗的巨大潜能.本文作者总结了近几年FAPI在肿瘤诊疗中的研究进展，重点介绍了新型FAPI在核医学领域肿瘤成像和治疗的应用，并从构效关系上讨论了增强FAPI选择性与延长保留时间的策略.1 FAPI的类型如图1所示，根据FAPI靶向弹头的伪肽结构，FAPI主要可分为下面几种类型：硼酸吡咯类、氯甲基酮类[8]和氰吡咯类.FAPI靶向弹头起抑制作用的机理是：FAPI中可分裂的肽键被不可分裂的亲电基团取代，引起FAP催化三联体中的丝氨酸羟基进行亲核攻击[9].硼酸吡咯类抑制剂由于对与FAP相关的多种脯氨酸肽酶有亲和力，对FAP的特异性受到了限制，并且还存在化学稳定性较低的缺点[10-11].而氰吡咯类抑制剂因为具有低纳摩尔FAP亲和性和高选择性等优异性质，已成为FAPI的主流构型.2014年，一种最有效的FAPI（简称：UAMC 1110）被开发出来，如图1（d）所示，它是一种典型的氰吡咯类抑制剂.目前，氰吡咯类抑制剂中具有代表性的是FAPI-02和FAPI-04，它们在临床实验中展现出高靶向性及高应用价值.另外，已有临床研究证明，相较于传统示踪剂氟代脱氧葡萄糖（FDG），FAPI-04在对各类肿瘤患者原發及转移灶的诊断上效果更优，尤其在肝转移瘤、腹膜癌、脑肿瘤的诊断上[12].FAPI-02和FAPI-04结构相似，两者的唯一区别在于FAPI-04的氰吡咯基团经二氟修饰，这增强了FAPI-04的疏水性，提高了抑制效力、配体效率和成纤维细胞活化蛋白与脯氨酰寡肽酶的比值（FAP/PREP）水平，提高了对FAP的选择性[13].2 增强FAPI选择性与延长保留时间的策略许多已设计出来的FAPI对底物并非最佳特异性，易从体循环中被快速清除，在肿瘤中停留时间短，这限制了FAPI靶向诊断的精准性，而且不利于其在生物体内的长期跟踪.同时，较长的药物循环时间和肿瘤滞留时间是FAPI应用于放射性治疗的先决条件，所以这还阻碍了FAPI在肿瘤放疗上的应用.因此，增强FAPI对肿瘤的选择性与延长在肿瘤的保留时间就显得尤为重要.在此，总结了近年来几种常用的增强FAPI选择性与延长保留时间的策略.2.1 构建二聚体衍生物构建二聚体衍生物实质是在一个分子上同时连接2个相同的靶向药效基团，在相同的纳摩尔数上增加了药效团的数量，提高了FAPI的选择性，并且该策略易于在合成中实现，是一种增强FAPI肿瘤积聚和延长保留时间的有效策略.如EUY等[15]合成了2种方酰胺（SA）偶联的同型二聚体FAP抑制剂DOTA.（SA.FAPI）2和DOTAGA.（SA.FAPI）2，与传统的单体衍生物抑制剂相比，明显改善了肿瘤积聚和保留时间.2.2 连接强效配位基团与构建二聚体衍生物相似，在抑制剂结构上连接强配位基团也能增加药效基团的数量，从而提高FAPI的选择性.如图2所示，RUAN等[16]在抑制剂上连接强配位基团异氰酸，合成并用放射性锝标记了该含异氰化物的FAP抑制剂[99mTc][Tc-（CN-PEG4-FAPI）6]+.该络合物具有6个配位位点，在单个分子上携带了更多的药效基团，具有更高的肿瘤摄取及更好的肿瘤靶向性，是一种很有前景的肿瘤显像剂.2.3 合理选择连接基团设计合成一个有效的FAPI，不仅需要考虑分子靶向识别位点的数量，还需要考虑靶向位点作用的空间位阻.在螯合剂和药效基团之间选择更柔性的连接基团可以使药物更好地渗透到结合位点，增强FAPI的选择性.如SLANIA等[11]合成了2种新型FAPI：QCP01和[111In]QCP02，采用了灵活的线性酰胺烷基链替代原本支架结构上半刚性的哌嗪基团，结合时更好地渗透到结合位点，显示出肿瘤的高摄取率.2.4 增加体内保留基团在FAPI上增加体内保留基团，增强与生物组织的结合能力，从而获得较长的药物循环时间和延长FAPI的保留时间.如图3所示，LIN等[17]设计了以环螯合物四西坦（DOTA）为68Ga标记位点的FAP特异性体内正电子发射断层扫描（PET）示踪剂[68Ga]Ga-Alb-FAPtp-01，并在其上增加了与内源性白蛋白结合的基团4-对氯苯丁酸，以此延长药物的循环时间，增加在肿瘤病变的滞留时间，改善整体药代动力.并且这种与白蛋白的结合能力，使得PAPI能够通过内在血管或内部流体压力被稳定扩散并运输到肿瘤内.3 新型FAPI在肿瘤诊疗中的应用3.1 FAPI在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断上，FAPI通过螯合不同的放射性核素，如68Ga，99mTc和18F等，进行核医学成像.目前基于FAPI的核医学成像主要包括PET影像和SPECT影像.在PET影像上，FAPI 除了在诊断原发及转移灶肿瘤上有优良的效果，在癌症的分级上也具有优势，如ROHRICH等[18]用68Ga标记的FAPI-02和FAPI-04对18例胶质瘤患者进行PET成像诊断，实现了世界卫生组织（WHO）认定的分级为II级和III/IV级的异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变星形细胞瘤的无创区分.虽然当前68Ga标记的FAPI在成像中得到了广泛关注，但由于68Ga的半衰期较短（半衰期（t1/2）为68 min），一次只能合成少量的放射性药物，并且不利于长距离的输送，这限制了68Ga-FAPI在实际医疗的应用.然而，放射性核素18F可以大量生产，并且它的发射器普遍可用，可以满足大量患者的需求.WANG等[19]开发了一种18F标记的铝与1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N，N-三乙酸（NOTA）螯合的Al18F-NOTA-FAPI成像探针，可以在人工操作下制备，实现高放射性的批量生产.另外，如图4所示，HU等[20]通过临床研究证明一种18F标记的新型成纤维细胞活化蛋白抑制剂[18F]FAPI-42在各種癌症患者中表现出较高的病变检出率，可以成为68Ga-FAPI-04的替代品.在SPECT影像方面，由于SPECT具有低成本和广泛使用的特点，99 mTc标记的FAPI在实际患者的影像诊断中具有较大的应用潜能.LINDNER等[21]对一系列FAPI进行了99 mTc标记和临床研究，发现FAPI-34是一个优良的SPECT显像剂，可以通过快速肿瘤摄取和身体其他部位的快速清除获得高的对比度.TRUJILLO-BENITEZ等[22]还首次用99 mTc标记了硼酸吡咯类FAPI，结果显示：该示踪剂在人血清中的放射稳定性高，对FAP具有特异性识别，实现在肿瘤的高摄取和在肾脏中的快速清除.3.2 FAPI在肿瘤治疗中的应用目前，基于FAPI特异性靶向肿瘤的作用，许多对癌症具有靶向治疗效果的药物被开发出来.FAPI在肿瘤治疗上的应用大致可分为两类：一类是在FAPI上进行放射性核素标记用于放疗;另一类是通过化学合成在FAPI上偶联化疗药物进行化疗.在放疗上，WATABE等[23]使用半衰期较长的64Cu（t1/2为12.7 h）和225Ac（t1/2为10 d）标记FAPI，研究α-疗法治疗肿瘤的效果，结果表明：放射性铜和锕标记的FAPI-04（64Cu-FAPI-04和225Ac-FAPI-04）可用于治疗高表达FAP的胰腺癌.另一方面，如图5所示，为了研究短半衰期高能量同位素，如铼（188Re）、砹（21At）和铋（213Bi）等用于肿瘤放射治疗的效果，MA等[24]用与21At 化学性质相近的131I标记了FAPI-04，为后续21At放疗试剂的开发铺平道路.治疗结果表明：该种放射药物在胶质瘤近距离放疗中具有巨大的潜力.2 增强FAPI选择性与延长保留时间的策略许多已设计出来的FAPI对底物并非最佳特异性，易从体循环中被快速清除，在肿瘤中停留时间短，这限制了FAPI靶向诊断的精准性，而且不利于其在生物体内的长期跟踪.同时，较长的药物循环时间和肿瘤滞留时间是FAPI应用于放射性治疗的先决条件，所以这还阻碍了FAPI在肿瘤放疗上的应用.因此，增强FAPI对肿瘤的选择性与延长在肿瘤的保留时间就显得尤为重要.在此，总结了近年来几种常用的增强FAPI选择性与延长保留时间的策略.2.1 構建二聚体衍生物构建二聚体衍生物实质是在一个分子上同时连接2个相同的靶向药效基团，在相同的纳摩尔数上增加了药效团的数量，提高了FAPI的选择性，并且该策略易于在合成中实现，是一种增强FAPI肿瘤积聚和延长保留时间的有效策略.如EUY等[15]合成了2种方酰胺（SA）偶联的同型二聚体FAP抑制剂DOTA.（SA.FAPI）2和DOTAGA.（SA.FAPI）2，与传统的单体衍生物抑制剂相比，明显改善了肿瘤积聚和保留时间.2.2 连接强效配位基团与构建二聚体衍生物相似，在抑制剂结构上连接强配位基团也能增加药效基团的数量，从而提高FAPI的选择性.如图2所示，RUAN等[16]在抑制剂上连接强配位基团异氰酸，合成并用放射性锝标记了该含异氰化物的FAP抑制剂[99mTc][Tc-（CN-PEG4-FAPI）6]+.该络合物具有6个配位位点，在单个分子上携带了更多的药效基团，具有更高的肿瘤摄取及更好的肿瘤靶向性，是一种很有前景的肿瘤显像剂.2.3 合理选择连接基团设计合成一个有效的FAPI，不仅需要考虑分子靶向识别位点的数量，还需要考虑靶向位点作用的空间位阻.在螯合剂和药效基团之间选择更柔性的连接基团可以使药物更好地渗透到结合位点，增强FAPI的选择性.如SLANIA等[11]合成了2种新型FAPI：QCP01和[111In]QCP02，采用了灵活的线性酰胺烷基链替代原本支架结构上半刚性的哌嗪基团，结合时更好地渗透到结合位点，显示出肿瘤的高摄取率.2.4 增加体内保留基团在FAPI上增加体内保留基团，增强与生物组织的结合能力，从而获得较长的药物循环时间和延长FAPI的保留时间.如图3所示，LIN等[17]设计了以环螯合物四西坦（DOTA）为68Ga标记位点的FAP特异性体内正电子发射断层扫描（PET）示踪剂[68Ga]Ga-Alb-FAPtp-01，并在其上增加了与内源性白蛋白结合的基团4-对氯苯丁酸，以此延长药物的循环时间，增加在肿瘤病变的滞留时间，改善整体药代动力.并且这种与白蛋白的结合能力，使得PAPI能够通过内在血管或内部流体压力被稳定扩散并运输到肿瘤内.3 新型FAPI在肿瘤诊疗中的应用3.1 FAPI在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断上，FAPI通过螯合不同的放射性核素，如68Ga，99mTc和18F等，进行核医学成像.目前基于FAPI的核医学成像主要包括PET影像和SPECT影像.在PET影像上，FAPI 除了在诊断原发及转移灶肿瘤上有优良的效果，在癌症的分级上也具有优势，如ROHRICH等[18]用68Ga标记的FAPI-02和FAPI-04对18例胶质瘤患者进行PET成像诊断，实现了世界卫生组织（WHO）认定的分级为II级和III/IV级的异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变星形细胞瘤的无创区分.虽然当前68Ga标记的FAPI在成像中得到了广泛关注，但由于68Ga的半衰期较短（半衰期（t1/2）为68 min），一次只能合成少量的放射性药物，并且不利于长距离的输送，这限制了68Ga-FAPI在实际医疗的应用.然而，放射性核素18F可以大量生产，并且它的发射器普遍可用，可以满足大量患者的需求.WANG等[19]开发了一种18F标记的铝与1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N，N-三乙酸（NOTA）螯合的Al18F-NOTA-FAPI成像探针，可以在人工操作下制备，实现高放射性的批量生产.另外，如图4所示，HU等[20]通过临床研究证明一种18F标记的新型成纤维细胞活化蛋白抑制剂[18F]FAPI-42在各种癌症患者中表现出较高的病变检出率，可以成为68Ga-FAPI-04的替代品.在SPECT影像方面，由于SPECT具有低成本和广泛使用的特点，99 mTc标记的FAPI在实际患者的影像诊断中具有较大的应用潜能.LINDNER等[21]对一系列FAPI进行了99 mTc标记和临床研究，发现FAPI-34是一个优良的SPECT显像剂，可以通过快速肿瘤摄取和身体其他部位的快速清除获得高的对比度.TRUJILLO-BENITEZ等[22]还首次用99 mTc标记了硼酸吡咯类FAPI，结果显示：该示踪剂在人血清中的放射稳定性高，对FAP具有特异性识别，实现在肿瘤的高摄取和在肾脏中的快速清除.3.2 FAPI在肿瘤治疗中的应用目前，基于FAPI特异性靶向肿瘤的作用，许多对癌症具有靶向治疗效果的药物被开发出来.FAPI在肿瘤治疗上的应用大致可分为两类：一类是在FAPI上进行放射性核素标记用于放疗;另一类是通过化学合成在FAPI上偶联化疗药物进行化疗.在放疗上，WATABE等[23]使用半衰期较长的64Cu（t1/2为12.7 h）和225Ac（t1/2为10 d）标记FAPI，研究α-疗法治疗肿瘤的效果，结果表明：放射性铜和锕标记的FAPI-04（64Cu-FAPI-04和225Ac-FAPI-04）可用于治疗高表达FAP的胰腺癌.另一方面，如图5所示，为了研究短半衰期高能量同位素，如铼（188Re）、砹（21At）和铋（213Bi）等用于肿瘤放射治疗的效果，MA等[24]用与21At 化学性质相近的131I标记了FAPI-04，为后续21At放疗试剂的开发铺平道路.治疗结果表明：该种放射药物在胶质瘤近距离放疗中具有巨大的潜力.2 增强FAPI选择性與延长保留时间的策略许多已设计出来的FAPI对底物并非最佳特异性，易从体循环中被快速清除，在肿瘤中停留时间短，这限制了FAPI靶向诊断的精准性，而且不利于其在生物体内的长期跟踪.同时，较长的药物循环时间和肿瘤滞留时间是FAPI应用于放射性治疗的先决条件，所以这还阻碍了FAPI在肿瘤放疗上的应用.因此，增强FAPI对肿瘤的选择性与延长在肿瘤的保留时间就显得尤为重要.在此，总结了近年来几种常用的增强FAPI选择性与延长保留时间的策略.2.1 构建二聚体衍生物构建二聚体衍生物实质是在一个分子上同时连接2个相同的靶向药效基团，在相同的纳摩尔数上增加了药效团的数量，提高了FAPI的选择性，并且该策略易于在合成中实现，是一种增强FAPI肿瘤积聚和延长保留时间的有效策略.如EUY等[15]合成了2种方酰胺（SA）偶联的同型二聚体FAP抑制剂DOTA.（SA.FAPI）2和DOTAGA.（SA.FAPI）2，与传统的单体衍生物抑制剂相比，明显改善了肿瘤积聚和保留时间.2.2 连接强效配位基团与构建二聚体衍生物相似，在抑制剂结构上连接强配位基团也能增加药效基团的数量，从而提高FAPI的选择性.如图2所示，RUAN等[16]在抑制剂上连接强配位基团异氰酸，合成并用放射性锝标记了该含异氰化物的FAP抑制剂[99mTc][Tc-（CN-PEG4-FAPI）6]+.该络合物具有6个配位位点，在单个分子上携带了更多的药效基团，具有更高的肿瘤摄取及更好的肿瘤靶向性，是一种很有前景的肿瘤显像剂.2.3 合理选择连接基团设计合成一个有效的FAPI，不仅需要考虑分子靶向识别位点的数量，还需要考虑靶向位点作用的空间位阻.在螯合剂和药效基团之间选择更柔性的连接基团可以使药物更好地渗透到结合位点，增强FAPI的选择性.如SLANIA等[11]合成了2种新型FAPI：QCP01和[111In]QCP02，采用了灵活的线性酰胺烷基链替代原本支架结构上半刚性的哌嗪基团，结合时更好地渗透到结合位点，显示出肿瘤的高摄取率.2.4 增加体内保留基团在FAPI上增加体内保留基团，增强与生物组织的结合能力，从而获得较长的药物循环时间和延长FAPI的保留时间.如图3所示，LIN等[17]设计了以环螯合物四西坦（DOTA）为68Ga标记位点的FAP特异性体内正电子发射断层扫描（PET）示踪剂[68Ga]Ga-Alb-FAPtp-01，并在其上增加了与内源性白蛋白结合的基团4-对氯苯丁酸，以此延长药物的循环时间，增加在肿瘤病变的滞留时间，改善整体药代动力.并且这种与白蛋白的结合能力，使得PAPI能够通过内在血管或内部流体压力被稳定扩散并运输到肿瘤内.3 新型FAPI在肿瘤诊疗中的应用3.1 FAPI在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断上，FAPI通过螯合不同的放射性核素，如68Ga，99mTc和18F等，进行核医学成像.目前基于FAPI的核医学成像主要包括PET影像和SPECT影像.在PET影像上，FAPI 除了在诊断原发及转移灶肿瘤上有优良的效果，在癌症的分级上也具有优势，如ROHRICH等[18]用68Ga标记的FAPI-02和FAPI-04对18例胶质瘤患者进行PET成像诊断，实现了世界卫生组织（WHO）认定的分级为II级和III/IV级的异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变星形细胞瘤的无创区分.虽然当前68Ga标记的FAPI在成像中得到了广泛关注，但由于68Ga的半衰期较短（半衰期（t1/2）为68 min），一次只能合成少量的放射性药物，并且不利于长距离的输送，这限制了68Ga-FAPI在实际医疗的应用.然而，放射性核素18F可以大量生产，并且它的发射器普遍可用，可以满足大量患者的需求.WANG等[19]开发了一种18F标记的铝与1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N，N-三乙酸（NOTA）螯合的Al18F-NOTA-FAPI成像探针，可以在人工操作下制备，实现高放射性的批量生产.另外，如图4所示，HU等[20]通过临床研究证明一种18F标记的新型成纤维细胞活化蛋白抑制剂[18F]FAPI-42在各种癌症患者中表现出较高的病变检出率，可以成为68Ga-FAPI-04的替代品.在SPECT影像方面，由于SPECT具有低成本和广泛使用的特点，99 mTc标记的FAPI在实际患者的影像诊断中具有较大的应用潜能.LINDNER等[21]对一系列FAPI进行了99 mTc标记和临床研究，发现FAPI-34是一个优良的SPECT显像剂，可以通过快速肿瘤摄取和身体其他部位的快速清除获得高的对比度.TRUJILLO-BENITEZ等[22]还首次用99 mTc标记了硼酸吡咯类FAPI，结果显示：该示踪剂在人血清中的放射稳定性高，对FAP具有特异性识别，实现在肿瘤的高摄取和在肾脏中的快速清除.3.2 FAPI在肿瘤治疗中的应用目前，基于FAPI特异性靶向肿瘤的作用，许多对癌症具有靶向治疗效果的药物被开发出来.FAPI在肿瘤治疗上的应用大致可分为两类：一类是在FAPI上进行放射性核素标记用于放疗;另一类是通过化学合成在FAPI上偶联化疗药物进行化疗.在放疗上，WATABE等[23]使用半衰期较长的64Cu（t1/2为12.7 h）和225Ac（t1/2为10 d）标记FAPI，研究α-疗法治疗肿瘤的效果，结果表明：放射性铜和锕标记的FAPI-04（64Cu-FAPI-04和225Ac-FAPI-04）可用于治疗高表达FAP的胰腺癌.另一方面，如图5所示，为了研究短半衰期高能量同位素，如铼（188Re）、砹（21At）和铋（213Bi）等用于肿瘤放射治疗的效果，MA等[24]用与21At 化学性质相近的131I标记了FAPI-04，为后续21At放疗试剂的开发铺平道路.治疗结果表明：该种放射药物在胶质瘤近距离放疗中具有巨大的潜力.2 增强FAPI选择性与延长保留时间的策略许多已设计出来的FAPI对底物并非最佳特异性，易从体循环中被快速清除，在肿瘤中停留时间短，这限制了FAPI靶向诊断的精准性，而且不利于其在生物体内的长期跟踪.同时，较长的药物循环时间和肿瘤滞留时间是FAPI应用于放射性治疗的先决条件，所以这还阻碍了FAPI在肿瘤放疗上的应用.因此，增强FAPI对肿瘤的选择性与延长在肿瘤的保留时间就显得尤为重要.在此，总结了近年来几种常用的增强FAPI选择性与延长保留时间的策略.2.1 构建二聚体衍生物构建二聚体衍生物实质是在一个分子上同时连接2个相同的靶向药效基团，在相同的纳摩尔数上增加了药效团的数量，提高了FAPI的选择性，并且该策略易于在合成中实现，是一种增强FAPI肿瘤积聚和延长保留时间的有效策略.如EUY等[15]合成了2种方酰胺（SA）偶联的同型二聚体FAP抑制剂DOTA.（SA.FAPI）2和DOTAGA.（SA.FAPI）2，与传统的单体衍生物抑制剂相比，明显改善了肿瘤积聚和保留时间.2.2 连接强效配位基团与构建二聚体衍生物相似，在抑制剂结构上连接强配位基团也能增加药效基团的数量，从而提高FAPI的选择性.如图2所示，RUAN等[16]在抑制剂上连接强配位基团异氰酸，合成并用放射性锝标记了该含异氰化物的FAP抑制剂[99mTc][Tc-（CN-PEG4-FAPI）6]+.该络合物具有6个配位位点，在单个分子上携带了更多的药效基团，具有更高的肿瘤摄取及更好的肿瘤靶向性，是一种很有前景的肿瘤显像剂.2.3 合理选择连接基团设计合成一个有效的FAPI，不仅需要考虑分子靶向识别位点的数量，还需要考虑靶向位点作用的空间位阻.在螯合剂和药效基团之间选择更柔性的连接基团可以使药物更好地渗透到结合位点，增强FAPI的选择性.如SLANIA等[11]合成了2种新型FAPI：QCP01和[111In]QCP02，采用了灵活的线性酰胺烷基链替代原本支架结构上半刚性的哌嗪基团，结合时更好地渗透到结合位点，显示出肿瘤的高摄取率.2.4 增加体内保留基团在FAPI上增加体内保留基团，增强与生物组织的结合能力，从而获得较长的药物循环时间和延长FAPI的保留时间.如图3所示，LIN等[17]设計了以环螯合物四西坦（DOTA）为68Ga标记位点的FAP特异性体内正电子发射断层扫描（PET）示踪剂[68Ga]Ga-Alb-FAPtp-01，并在其上增加了与内源性白蛋白结合的基团4-对氯苯丁酸，以此延长药物的循环时间，增加在肿瘤病变的滞留时间，改善整体药代动力.并且这种与白蛋白的结合能力，使得PAPI能够通过内在血管或内部流体压力被稳定扩散并运输到肿瘤内.3 新型FAPI在肿瘤诊疗中的应用3.1 FAPI在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断上，FAPI通过螯合不同的放射性核素，如68Ga，99mTc和18F等，进行核医学成像.目前基于FAPI的核医学成像主要包括PET影像和SPECT影像.在PET影像上，FAPI 除了在诊断原发及转移灶肿瘤上有优良的效果，在癌症的分级上也具有优势，如ROHRICH等[18]用68Ga标记的FAPI-02和FAPI-04对18例胶质瘤患者进行PET成像诊断，实现了世界卫。
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任君琳 1 ,王 涛 2 ,许彦鸣 2 ,孟艳玲 1 ,温伟红 1 ,张 瑞 2 ,张 巍 1 ,杨安钢 1
(第四军医大学基础部 : 1免疫学教研室 , 2 生物化学与分子生物学教研室 ,陕西 西安 710033)
Gene con struction, expression and activ ity iden tif ica tion of recom b inan t an ti2HER2 ScFv / FD T / ca spa se26
收稿日期 : 2006211213; 接受日期 : 2006212215 基金项目 :国家重点基础研究发展计划 ( 2004CB518805 ) ; 教育部长江
学者 和 创 新 团 队 发 展 计 划 ( IRT0459 ) ; 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 30370314, 30400403) 通讯作者 :杨gyang@ fmmu. edu. cn 作者简介 :任君琳. 硕士生 (导师杨安钢 ). Tel: ( 029 ) 84774531 Ext. 805 Email: renjunlin@ hotmail. com
【Abstract】A IM : To construct the recombinant exp ression vector of anti2HER2 ScFv / FDT/ caspase26 and investigate its p ro2apop2 tosis activity after transfected into gastric cancer SGC7901 cells. M ETHOD S: Anti2HER2 ScFv ( e23 sFv) was attached to human recombinant caspase26 (RC6) gene by recombinant PCR , and the Furin recognition site of diphtheria toxin ( FDT) served as the linker to construct e23 sFv2FDT2RC6 recombinant gene. The re2 combinant gene was cloned into the vector pCMV , and the recom2 binant p lasm id was transiently transfected into HER2 positive SGC7901 cells and HER2 negative HeLa cells via lipofectam ine mediation. M TT assay was used to show how the cell living status was affected by the gene transfection. The p ro2apop totic activity of recombinant p lasm id was detected by indirect immunofluorescent staining. RESUL TS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing p roved that e23 sFv2RC6 and e23 sFv2FDT2RC6 genes had been cloned into vector pCMV. After transfection, the exp ression of fusion p rotein was found through W estern B lot. M TT assays showed that the grow th of SGC7901 cells was inhibited. Typ ical apop totic changes of the SGC7901 cells transfected w ith pCMV 2e23 sFv2FDT2RC6 were seen by indirect immunofluorescent staining. CO NCL US IO N: The exp ression of recombinant anti2 HER2 ScFv / FDT/ caspase26 gene can induce the apop tosis of HER2 positive SGC7901 cells. 【Keywords】ScFv antibody; caspase26; apop tosis
【摘 要 】目的 :构建重组抗 HER2 ScFv/ FDT/ caspase26 基因 的表达载体 ,转染 SGC7901 胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法 :采用重组 PCR法 ,将抗 HER2的单链抗体 ( e23 sFv)通过 白喉毒素的 Furin 识别位点的编码序列 ( FDT) 与人重构型 caspase26 ( RC6 ) 基因重组 , 构建融合蛋白表达基因 e23 sFv2 FDT2RC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体 pCMV , 以脂质体法瞬时转染 HER2阳性的 SGC7901细胞和 HER2阴 性的 HeLa细胞. M TT法检测目的基因转染后细胞的增殖情 况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对 SGC7901细胞 的促凋亡作用. 结果 :把 e23 sFv2RC6, e23 sFv2FDT2RC6基因克 隆入真核表达载体 pCMV ,酶切鉴定和基因测序证明目的基 因序列正确. 转染 SGC7901 和 HeLa细胞后 , W estern B lot检 测到目的蛋白的表达. M TT实验观察到转染 pCMV 2e23 sFv2 FDT2RC6的 SGC7901细胞的增殖被明显抑制 ,间接免疫荧光 染色可以观察到表达 e23 sFv2FDT2RC6 融合蛋白的 SGC7901 细胞形态发生改变 ,部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论 :重组 抗 HER2 ScFv/ FDT/ caspase26基因的表达可促进 HER2 阳性 SGC7901胃癌细胞的凋亡. 【关键词 】ScFv抗体 ; caspase26基因 ;细胞凋亡 【中图号 】Q786 【文献标识码 】A
R EN J un2L in1 , WAN G Tao2 , XU Yan2M ing2 , M EN G Yan2L ing1 , W EN W ei2Hong1 , ZHAN G R u i2 , ZHAN G W ei1 , YAN G A n2Gang1 1Department of Immunology, 2Department of B iochem istry and Molecular B iology, School of Basic M edicine, Fourth M ilitary M edical University, Xiπan 710033, China
0 引言
Caspase26是介导细胞凋亡的重要蛋白酶 ,其蛋 白含有 3个结构域 :原结构域 、大亚基和小亚基 [ 1 - 3 ]. 大小亚基顺序进行重排的 caspase26分子即 Reversed caspase26 (RC6)具有天然 caspase26 的活性 ,且能在 体外 识 别 并 切 割 PARP 及 Lam in A 等 底 物 [ 4 - 5 ]. HER2 / neu是表皮生长因子 ( ep idermal grow th factor, EGF)受体家族成员之一 ,其表达量与肿瘤的恶性程 度及预后相关. HER2是一种公认的肿瘤标志物 ,是 抗肿瘤治疗的理想靶标 [ 6 - 7 ]. 在我国 ,部分胃癌患者 HER2特异性高表达. 我们将抗 HER2 的单链抗体 ( e23 sFv)基因通过白喉毒素 (D iphtheria toxin, DT) 的 Furin识别位点的编码序列 ( FDT)与人 RC6 基因 重组 ,构建了融合蛋白表达基因 e23 sFv2FDT2RC6 及 不含 Furin识别位点序列 e23 sFv2RC6的真核表达载 体 ,并将其瞬时转染 SGC7901 细胞和 HeLa细胞 ,观 察其表达产物对转染细胞生长的影响.
GGC AAT AGA GTG AGG AGA TCT GTG GGC GCA GCC TCC GTT TAC 3′; ②w2: 5′TTT GCG GCC GCG AAA GCA GCC TCC GTT TAC 3′; ③w3: 5′TTT TCT AGA TTA ATC TAC TAC ATC CAA AGG AAT 3′. 1. 2. 2 细胞转染 将处于对数生长期的细胞 ,用 2. 5 g /L胰酶消化后 ,以 5 ×105 /孔接种于 6孔板中 ,继续 培养 24 h. 待汇合率达到 80%后 ,吸出培养液 ,用不 含血清的 RPM I 1640将细胞冲洗 2遍. 取 3μg /孔的 pCMV , pCMV 2e23 sFv2FDT2RC6 和 pCMV 2e23 sFv2RC6 分别溶于 500μL RPM I 1640培养液 ,称为 A1, A2, A3 液 ; 将 3份 6 μL /孔的 L ipofectam ine2000TM分别溶于 500μL RPM I 1640 培养液 ,室温孵育 2 m in,为 B1, B2, B3液 ;将 A1和 B1, A2和 B2, A3和 B3两液分别 混合 , 室温孵育 20 m in, 缓缓滴加至 6 孔 板中 , 于 37℃, 50 mL /L CO2 条件下培养 8 h. 吸弃转染液 ,加 入 1 mL 含 100 mL /L 小牛血清的无抗生素的 RPM I 1640培养液 ,继续培养. 1. 2. 3 W estern B lot检测 将已处理的蛋白样品进 行 SDS2PAGE电泳 ,电压分别为浓缩胶 80 V ,分离胶 为 150 V; 100 V 转移 2 h至 NC膜上 ;将 NC膜浸在封 闭液 (50 g /L 脱脂奶粉溶于 TB S)中 ,在室温下封闭 1 h;加入以封闭液 1 ∶300 稀释的一抗 , 4 ℃过夜 ; 用 TB ST ( 10 mmol/L Tris·HC l, pH 7. 5, 150 mmol/L NaC l, 1 mL /L Tween220)洗膜 , 5 m in ×3 次 ; 加入以 封闭液 1 ∶1000稀释 HRP标记的二抗 ,室温下放置 1 h; TBST洗膜 , 5 m in ×3 次 ;加入发光液浸泡 NC 膜 5 m in;暗室内压片 ,显影 ,定影 ,显现目的条带后及时以 自来水冲洗终止反应.