抗铜绿假单胞菌PcrV蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证
铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达【摘要】目的克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP 潜在的受体分子奠定实验基础。
方法提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA, 用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz 结构域蛋白基因, 将其克隆到原核表达载体pET32a中, 在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。
结果成功扩增出七种含Pilz 结构域蛋白基因并构建其原核表达载体, 测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。
SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。
结论从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz 结构域蛋白基因,其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。
【关键词】铜绿假单胞菌;c-di-GMP第二信使;Pilz结构域蛋白;基因克隆;原核表达载体构建铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa ), 又称绿脓杆菌, 是临床感染性疾病中常见的条件致病菌之一。
该菌致病机制复杂而多样, 其固有的对抗生素和消毒剂的耐受性使治疗十分困难。
铜绿假单胞菌全基因组测序的完成[1], 特别是近几年环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)对细菌生物学功能调控作用的突破性研究进展, 使得我们在分子水平上深入探讨其耐药机理, 在信号途径的研究中寻找新的作用靶点成为了可能。
作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使, c-di-GMP 参与调控了多种细菌生物学功能,如细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性及细菌的群体感应等[2],但其作用机制尚不完全清楚。
铜绿假单胞菌全基因组共有5,670个基因, 利用生物信息学手段,在其全基因组中发现了八种编码Pilz结构域(Pfam07238)蛋白基因。
铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达张万山;陈燕;曹郁生【期刊名称】《南昌大学学报(医学版)》【年(卷),期】2004(044)002【摘要】目的在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OPrH,获得重组融合蛋白OprF/H,为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础.方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因,扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后,割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒,测序后构建表达质粒pGEX-F/H,并转化大肠杆菌BL2l.结果重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF/H.结论成功构建融合外膜蛋白OprF/H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功.【总页数】5页(P5-9)【作者】张万山;陈燕;曹郁生【作者单位】江西医学院第一附属医院烧伤中心,江西,南昌,330006;中德联合研究院教育部食品科学重点实验室,江西,南昌,330047;中德联合研究院教育部食品科学重点实验室,江西,南昌,330047【正文语种】中文【中图分类】R378.99+1【相关文献】1.铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达 [J], 罗晓庆;孙济宇;王慧;王晓波;王琪;蒋瑞雪2.重组绿脓杆菌外膜蛋白OprF的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定 [J], 陈春琳;刘祥;俱雄3.铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状 [J], 梁诚诚;李文桂4.铜绿假单胞菌F190—342-I21—83基因的克隆及其融合蛋白的原核表达 [J], 张明亮;闫新武;孙长江;顾敬敏;崔子寅;韩文瑜5.重组铜绿假单胞菌外膜蛋白D的原核表达与多克隆抗体制备研究 [J], 伍娜娜;荣娜;康超;刘祥;陈琛;陈春琳;马心怡;吴三桥因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
重组铜绿假单胞菌外毒素A和pcrV基因质粒的构建及真核表达

论 著(基础研究)重组铜绿假单胞菌外毒素A和pcrV基因质粒的构建及真核表达姜明子,冯旰珠 [摘要] 目的 外毒素A(toxA基因编码)是铜绿假单胞菌毒力最强的因子之一,PcrV(pcrV基因编码)是铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的关键调控因子之一。
文中旨在构建重组toxA和pcrV基因的铜绿假单胞菌核酸疫苗,并在HEK-293细胞中表达目的蛋白。
方法 PCR法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出toxA和pcrV基因,点突变法对toxA基因进行减毒优化,随后将突变的toxAm基因和pcrV基因分别插入pIRES真核表达质粒的2个多克隆位点,构建真核双表达重组质粒pIRES-toxAm-pcrV。
脂质体法将pIRES-toxAm-pcrV瞬时转染入HEK-293细胞,通过Westernblot检测toxAm及pcrV在真核细胞中的表达。
结果 构建的真核表达质粒pIRES-toxAm-pcrV,经脂质体转染HEK-293细胞后,在其细胞内检测到目的蛋白的表达。
结论 成功构建pIRES-toxAm-pcrV表达载体并在转染的真核细胞中得以有效的表达,为研究铜绿假单胞菌预防性疫苗奠定了实验基础。
[关键词] 铜绿假单胞菌;外毒素A;核酸疫苗;pcrV基因 [中图分类号] R563 [文献标志码] A [文章编号] 1008-8199(2014)07-0694-04基金项目:江苏省卫生厅面上项目(H200911)作者单位:210011南京,南京医科大学第二附属医院呼吸内科[姜明子(医学硕士研究生)、冯旰珠]通讯作者:冯旰珠,E-mail:fenggz@njmu.edu.cnConstructionandeukaryoticexpressionofarecombinantplasmidencodingPseudomonasaeruginosatoxAandtypeⅢsecretionsystempcrVJIANGMing-zi,FENGGan-zhu(DepartmentofRespiratory,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,Jiangsu,China) [Abstract] Objective ExotoxinA(encodedbygenetoxA),oneofthemosttoxicproteinsecretedbypseudomonasaerugi-nosa(P.a.),andPcrV(encodedbygenepcrV),keycomponenttotypeⅢsecretionsystemofP.a.,bothmattersignificantlytothevirulenceofP.a.ThearticlewastoconstructanovelDNAvaccineencodingamutatedtoxAgeneandthepcrVgeneofP.a.andi-dentifygeneexpressionsineukaryoticcells. Methods ThegenesoftoxAandpcrVwereamplifiedbyPCR,andthetoxAgenewasmutatedtoreducethetoxicityofExotoxinA.ThengenefragmentstoxAmandpcrVwereinsertedintoeukaryoticexpressionplasmidpIRESsimultaneouslytoconstructarecombinantDNAvaccinepIRES-toxAm-pcrV.ThenovelplasmidwastransfectedintoHEK-293cellsbylipofectamine2000.TheexpressionsoftoxAmandpcrVweredetectedbyWesternblot. Results Gelelectrophoresisdemon-stratedthetargetgenefragmentsencodingExotoxinAandPcrV.WesternblotexhibitedproteinsencodedtoxAandpcrVexpressedbyHEK293cells. Conclusion TherecombinantplasmidpIRES-toxAm-pcrVwassuccessfullyconstructed.Westernblotanalysisindi-catedtheexpressionsoftoxAmandpcrVinHEK-293cells.ItmaybeusedasapotentialcandidateofpreventivevaccineofPseudo-monasaeruginosa. [Keywords] Pseudomonasaeruginosa;ExotoxinA;DNAvaccine;PcrV0 引 言 铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa,PA)是常见的条件致病菌,在各种医院感染中居于前位,也是慢性阻塞性肺疾病及气管扩张症反复感染者的常见的致病菌。
铜绿假单胞菌PcrV疫苗的研制现状

• 158 •国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期Inter J Epidemiol Infect Dis,April 2021,Vol. 48,N〇.2铜绿假单胞菌P c rV疫苗的研制现状李文桂陈雅裳重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所400016通信作者:李文桂,E m a i l:c q liw e n g u i@163.c o m•综述•【摘要】铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。
PcrV蛋白作为一种转运蛋白,是重要的免疫调控靶点,可作为一种有效的疫苗候选分子。
本文综述了PcrV蛋白、PcrV抗体、核酸疫苗以及重组鼠伤寒沙门菌疫苗等的研究现状,为新型疫苗研发提供参考。
【关键词】假单胞菌,铜绿;PcrV蛋白;疫苗;转运蛋白;抗体基金项目:国家自然科学基金(30801052、30671835、30500423、30200239)D0I : 10.3760/331340-20200623-00205Recent advances in PcrV vaccine against Pseudomonas aeruginosaLi Wengui, Chen YalongInstitute o f Infectious and Parasitic Diseases^ the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, ChinaCorresponding author \ Li Wengui, Email :******************【Abstract】Pseudomonas aeruginosa is one type of pathogens causing nosocomial infections. It recentlybecomes highlight to control this bacterium by the application of related vaccine. PcrV protein, as a transport protein,is an important target for immune regulation and an effective candidate molecule of vaccine. The review outlines theresearch of PcrV protein, PcrV antibody, nucleic acid vaccine, and recombinant Salmonella typhimurium vaccine, inorder to provide references for the development of novel vaccine.【Key words】aenxgifwwa; PcrV protein; Vaccine; Transport protein; AntibodyFund program:National Natural Science Foundation of China(30801052, 30671835, 30500423, 30200239)DOI : 10.3760/331340-20200623-00205铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌'I D型分泌系 统(T3SS)是其主要致病因子,可协助其逃避巨噬细胞的吞噬和降解|21。
铜绿假单胞菌flgE和oprL基因联合DNA疫苗的免疫效果

Abstract:In order to detect the immune efficacy of a bivalent combination DNA vaccine of Pseudo monas aeruginosa ,two recombinant plasmids pflgE and pOPRL were constructed,and the bivalent combination DNA vaccine pflgE+pOPRL were prepared.Subsequently,the BALB/c mice were immunized with these DNA vaccines, and inactivated vaccines was as positive controls,and pcDNA3. 1( + ) and PBS were as negative controls, respectivly.Then the level of serum antibody were detected by indirect ELISA,and the lymphocyte proli feration assay was detected by MTT,and the concentrations interferon-y (IFN^y ),interleukin-2 (IL-2) and interleukin-4 (IL~4) were detected by double antibody sandwich ELISA,stly,the protec tion rates were assessed after challenging with virulent P.aeruginosa.ELISA indicated that,the anti body levels in the pflgE+pOPRL group were higher than that of in the pflgE group and pOPRL group (P <0. 05) when P.aeruginosa lysis solution was adopted as a coating antigen.However,when the fimbirae protein
铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研究的开题报告

铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研
究的开题报告
题目:铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研究
研究背景及意义:
铜绿假单胞菌是一种常见的病原菌,具有很强的耐药性,对于临床治疗带来了很大的挑战。
其外膜是维持细胞形态结构、保护内部细胞壁和细胞膜的重要部位,同时还是细胞与外界环境物质交换的重要通道。
外膜上的蛋白质是其功能的关键部位,因此对铜绿假单胞菌外膜蛋白质组学的研究有助于深入了解其对于药物耐药性和原功能的影响。
研究内容和方法:
本研究将利用质谱分析技术对铜绿假单胞菌外膜蛋白质组进行全面的分析,进而筛选耐药相关蛋白及其保护原功能的蛋白。
从而通过建立耐药性相关蛋白与保护功能蛋白的相关性,探究其在铜绿假单胞菌外膜上的相互作用机制,从而揭示其耐药机制,为新药的研发提供指导。
研究预期结果与意义:
本研究将可以全面了解铜绿假单胞菌外膜的蛋白质组学,并从中发掘出耐药相关蛋白及其保护原功能蛋白。
这将有助于探究铜绿假单胞菌的耐药机制,为疾病的治疗和新药的研发提供理论基础。
同时,本研究还有助于深入了解细菌外膜的功能和机制,为细菌学研究提供重要的参考。
铜绿假单胞菌耐药相关蛋白的研究进展

旦堕竖堕塑查!!!!至簦!!鲞箜!塑!坐!垦!!丛!:垒P!:!!!!:∑!!:!!!型!:!铜绿假单胞菌耐药相关蛋白的研究进展蔡双启陈一强【摘要】铜绿假单胞菌(Rg“dDmo”nsner“g抽os。
,PA)是医院感染及免疫缺陷者感染的常见致病菌。
PA基因测序工作的完成,为研究其耐药相关蛋白奠定了基础。
近年来由于各种抗菌药物的广泛应用甚至滥用,PA对抗生素耐药日趋严重。
本文就PA对抗生素耐药相关蛋白质的研究作一综述,详细介绍PA主动外排系统相关蛋白、外膜微孔蛋白、青霉素结合蛋白、生物膜相关蛋白以及其他一些蛋白导致PA对抗生素耐药的相关机制。
【关键词】铜绿假单胞菌;耐药相关蛋白;研究进展Researchprogressonantibiotje-resistanceassociatedproteinofPsP口do,拜D露口snPrHgf咒os口(、AjS^“Ⅱ村g—gi,CHENyi—qi口行g.DP户口以,聍P雄fo,RPs户i,硷fDryMPdifi行P,历已Fir时A,,iZi口fPdH05声if口£D,G“口行gziMPdicnfU,2i口Prs打y。
^『口聍理i"g530021,(强i行n【Abstr8ct】j%P“do,"D行口s口Pr“gi行osdisacommonpathogenicbacteriumofnosocomialinfectionsandinfectionsinthegroupwithimmunedeficiency.Asubstantialfundamentforthestudyofantibiotic—resistanceassociatedproteinissettledwiththeaccomplishmentofj专P铭domo行Ⅱ5“PrMgi砣Dsn’sgenesequencing.Recently,j%P“domD咒口snPr“gi”os以showsamoreandmoreseriousantibiotic—resistancetendencyfromtheuseorevenabuseofvariouskindsofantibacterials.Thisarticlesummarizestheantibiotic—resistantassociatedproteinofPsP“do,no”口5nPr“gi行osn,mainlyeffluxsystemassociatedprotein,porin,peniciIlin—bindingprotein,bio“lmassociatedproteinandsomeotherproteins,andthemechanismsofP5P“do,"o,znsnFr“gi对os“resistanttoantibacterials.【Keywords】j%F“do,”o行口5nPr“gi挖os口;Antibiotic—resistantassociatedprotein;Researchprogress铜绿假单胞菌(AP“矗omo挖口snPr“gi以os口,PA),又叫绿脓杆菌口],是呼吸系统、泌尿系统等感染的常见病原菌,也是医院感染最常见的革兰阴性杆菌之一[2],主要感染医院内免疫力低下患者[3],其感染具有难治性、高耐药性和高病死率的特点。
铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶的克隆表达与功能鉴定的开题报告

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶的克隆表达与功能鉴定的开题报告一、研究背景噬菌体是一种感染细菌的病毒,可以用来对抗一些耐药性细菌的感染。
噬菌体通过其特异性的受体与宿主细胞表面互相吸附,然后将其遗传物质注入细胞内部,利用宿主细胞的生物合成机制复制自身,并最终导致宿主细胞破裂释放新的噬菌体。
其中,噬菌体末端酶(Endolysin)是一种能够降解细菌细胞壁的酶,是噬菌体的重要成分之一。
末端酶可以在噬菌体释放前部分地降解细菌细胞壁,从而使噬菌体释放更容易。
同时,末端酶也可以在噬菌体释放后迅速降解宿主细胞壁,释放更多的噬菌体,加速细胞的破裂。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种可以感染人类的细菌,尤其在免疫力低下的患者中容易引起感染。
由于其常常具有多重耐药性,传统药物治疗效果有限。
因此,利用噬菌体进行治疗成为一种新兴的治疗手段。
本项目的研究目的是克隆和表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶,并从分子水平上探究其降解细菌细胞壁的功能特点。
二、研究内容和方法1.克隆铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶基因从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,利用PCR扩增末端酶基因,并将其插入到表达载体中。
最终,利用DNA测序验证插入正确。
2.表达末端酶将重组表达载体转化到大肠杆菌中,利用蛋白质表达系统进行表达。
3.纯化蛋白利用GST标签纯化GE柱对重组末端酶进行纯化和富集。
4.酶活性测定利用酶标仪测定样品的吸光度值,从而确定蛋白的酶活性,评估其降解细菌细胞壁的能力。
三、研究意义和创新性本项目的研究对于探究铜绿假单胞菌的噬菌体末端酶的功能特点具有重要意义,并可以为噬菌体在临床应用上的推广提供参考。
同时,通过克隆和表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶,也有助于解析其他细菌噬菌体末端酶的同源性和结构功能关系,具有一定的创新性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
抗铜绿假单胞菌PcrV蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证管章春;刘方杰;刘成华;高亚萍;沈倍奋;杨光
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】2018(034)002
【摘要】目的:获得能应用于治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的抗PcrV蛋白全人源单克隆抗体.方法:以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板,PCR 扩增 PcrV 基因并构建重组表达载体 pET-28a-PcrV,转化至大肠杆菌 BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达,并通过镍离子螯合树脂亲和纯化PcrV蛋白.利用噬菌体抗体库筛选PcrV结合的噬菌体克隆并进行序列测定,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR扩增该抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因并构建重组表达载体转染至293E细胞,收取培养细胞上清,并利用Protein A树脂亲和纯化抗体.利用ELISA 实验检测抗体亲和力,并通过小鼠铜绿假单胞菌感染肺炎模型验证抗体活性.结果:获得重组蛋白PcrV,通过噬菌体展示技术筛选并制备了一株全人源抗PcrV单克隆抗体YG5.ELISA实验结果表明YG5抗体具有较高的亲和力(EC50=61 ng/ml),进一步的实验结果表明,YG5能有效抵抗铜绿假单胞菌感染,降低小鼠的死亡率.结论:靶向铜绿假单胞菌PcrV蛋白的全人源单克隆抗体YG5能够有效地抑制铜绿假单胞菌致病性,降低其对机体感染,有可能成为抗铜绿假单胞菌感染的治疗性抗体.
【总页数】6页(P233-238)
【作者】管章春;刘方杰;刘成华;高亚萍;沈倍奋;杨光
【作者单位】广西医科大学,南宁530000;广西医科大学,南宁530000;军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850;广西医科大学,南宁530000;军事
医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850;广西医科大学,南宁530000;军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850;广西医科大学,南宁530000;军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850;广西医科大学,南宁530000;军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850
【正文语种】中文
【中图分类】R392.1
【相关文献】
1.可阻断IBDV感染的抗CEF膜蛋白单克隆抗体的筛选 [J], 杨艳艳;朱礼倩;杨继飞;滕蔓;柴书军;王丽;罗俊;邓瑞广;张改平
2.抗BSA多克隆抗体和单克隆抗体筛选及双抗体夹心ELISA法的建立与验证 [J], 李静;蔡芳;宋莉莉;高强
3.抗胃癌干细胞单克隆抗体的筛选鉴定及功能研究 [J], 遇珑;舒雄;刘军;孙力超;杨治华;冉宇靓
4.功能差异细胞模型筛选抗肺癌功能性单克隆抗体及其抗原 [J], 卢燕来;冉宇靓;遇珑;赵西路;刘军;胡海;杨治华
5.卡介苗胞壁蛋白增强肺抗铜绿假单胞菌感染防御功能的研究 [J], 刘小康;周慧;黄宁;祝秉东;冯云;吴琦;王伯瑶
因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。