铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究
铜绿假单胞菌生物学特性、实验室检查、生化鉴定、临床症状、耐药性及预防措施
铜绿假单胞菌生物学特性、实验室检查、生化鉴定、临床症状、耐药性及预防生物学特性铜绿假单胞菌是常见条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。
菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
铜绿假单胞菌为专性需氧菌，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。
在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，绿脓素与带荧光的水溶性荧光素等。
在血平板上会有透明溶血环。
含有O抗原以及H抗原。
O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。
O抗原可用以分型。
实验室检查标本来源。
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。
还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。
染色镜检。
为革兰阴性杆菌，菌体大小(1.5~5.0)um×宽(0.5~1)um，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，无荚膜。
分离培养本菌生长对营养要求不高。
对有正常菌群存在的临床标本或来自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基(MAC)；对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通全营养型培养基或血琼脂培养基、铜绿假单胞菌培养基。
普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落，该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽；在铜绿假单胞菌培养基上呈蓝绿色或者红褐色菌落，365nm紫外灯下显荧光。
如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长，在液体表面形成菌落，而在培养基底部的细菌生长不良。
生长实验。
铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长。
生化鉴定分型(1)噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。
铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析
ｐ ａｅ． ￣ｏｓ Ｂｃ ｒｐａｅ ｅｅ ｈｇｓ Ｍｅ ｄ ａｔ ｉ ｈｇｓ ｒ ｅｏ ｗ
摘要 ： 目的 分离 鉴定铜绿假单胞 菌噬菌 体 ， 对其生物 学特性进行 研究 。方法 并 从居 民胞菌噬体 ， 利用噬斑测定法纯 化所 分离 的噬菌 体 ， 过负染 法电镜观察 噬菌体形 态及大小 。观察并测 通 定噬菌体一步生产 曲线 ， 提取 噬菌体核酸并进行 酶切 电泳 。结 果 利用 ２ 株铜绿假单胞 菌为宿 主菌 ， 下水道 中分 １ 从
郑文旭 成伏 波 张 学英 孙延 波 ， ， ， ， 徐德启
（． １吉林大学第二临床学院 ， 吉林 长 春 １０４ ；． ３０ １２ 吉林 大学白求 恩医学 院 病原生物学教研室 ；
３ 吉林大学中 日联 谊医院 检验科 ； ． 国食品药 品管理 局 肠道和性传播疾病实验室 ） ． ４美
关键词 ： 绿假 单胞 菌 ； 铜 噬菌体 ； 一步 生长 曲线 ，
中 图分 类 号 ：４６ ５ Ｒ４ ．
ＢｉｌｇｃｄＩＩ ｃｅｉ ｏｏ ｉ ［ ｔｒ ＝ ｌ
分离 出的噬菌体具有较广 的噬菌谱 ， 潜伏期短 ， 裂解 量较大 ， 为噬菌体 作为生物 制剂
文献标识码 ： Ａ
ｏ ｓ￣ ｏ ｎｓａ ｒｇ ￣ｓ ￣ ｅ ｆＰ ｅ ｍｏ ｏ ｅｕ ｂｏａ ｌａｇ ｓ￣ ｌｔｄ ｆｏ ｒ ｗ ｅ ｇ Ｚ ｅｇ Ｉｅ－ｕ ， ｈｎ ｕ ｂ Ｚ ａ ｇ ａｅ ｒ ｍ ａ ｓｗａ ｅ ｈｎ ｌｎｘ Ｃ ｅｇ Ｆ －ｏ ， ｈ ｎ Ｔ
ｓ ａ ｓａ ｏｔ ． ｈ ｇ Ａ ｗａ ｘｒｃｅ ｎ ｉｅ ｔ ｔ ｉ ｓｈ ￣ｓ Ｐ ａ ｅＤＮ ｓｅ ｔ ｔ ａ ｄｄ ｇ ｓ— ｒｎ ａ ｄ
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查铜绿假单胞菌是一种常见的细菌，它属于铜绿假单胞菌属，是一类极耐环境和抗生素的细菌。
铜绿假单胞菌广泛存在于自然环境中，如土壤、水体、植物等。
它也是人体的正常菌群之一，可以在人体的皮肤、呼吸道、胃肠道等部位自然存在。
然而，在一些病理条件下，铜绿假单胞菌也可以引起各种感染，威胁人类健康。
铜绿假单胞菌的分离鉴定是为了了解其在环境中的分布情况及其对人体的感染能力。
流行病学调查的目的是确定感染源和传播途径，为疫情的控制和防止提供参考。
首先，进行铜绿假单胞菌的分离。
分离铜绿假单胞菌的方法一般是通过在不同的样本（如土壤、水、食品等）上进行菌落计数，从中选取典型的铜绿假单胞菌菌落进行进一步的分离。
常用的分离培养基有MacConkey琼脂和铜绿红脂琼脂两种。
分离完成后，可以通过染色和显微观察来初步鉴定。
其次，进行铜绿假单胞菌的鉴定。
铜绿假单胞菌的鉴定可以使用生化试验和分子生物学方法。
常用的生化试验包括氧化/发酵试验、涂片鉴别、目视鉴别等。
通过观察菌落形态、菌液性状和气泡产生情况等特征，可以初步鉴定铜绿假单胞菌。
进一步的鉴定可以使用分子生物学技术。
通过提取细菌的基因组DNA，可以进行PCR扩增和测序，根据16S rRNA或其它特定基因的序列，与数据库中的铜绿假单胞菌序列进行比对，从而确认其物种鉴定。
最后，进行流行病学调查。
流行病学调查的主要目标是确定感染源和传播途径，以便采取相应的控制措施。
调查可以从病例调查开始，通过回顾病例的流行病学信息，如患者的接触史、食物来源等，可以初步确定感染源。
此外，还可以进行对病例周围环境的调查，包括采集患者及其周围环境的标本，并进行铜绿假单胞菌的分离和鉴定，以确定感染源。
流行病学调查还需要进行流行病学学者之间的信息交流与合作，以便对大规模的疫情进行及时的跟踪和分析。
同时，通过对病例的进一步调查和控制措施的实施，可以减少铜绿假单胞菌感染的发生率，保障人们的健康。
噬菌体在疾病治疗方面的应用和发展趋势
噬菌体在动物疾病治疗的应用和展望摘要：如今细菌耐药能力的增强，动物肿瘤的频发以及不少珍稀动物濒临灭绝，使得迫切需要一种能有效抑制疾病发展的药物。
而噬菌体作为一种特殊的病毒，具有“捕食”细菌和治疗癌症的能力，能有效治疗疾病的发展。
人们也逐渐开始重视噬菌体在疾病治疗中的应用潜能。
本文就噬菌体治疗的发现，实际应用，优势及其中所包含的缺陷问题进行综述，并对噬菌体治疗的未来提出展望。
关键词：噬菌体，细菌，肿瘤，治疗Abstract：With the increase of the tolerance in bacteria,the frequent cancer and many endangered animals , we urgently need a pill which can effectively inhibit the development of the disease. Phages as a special type of virus, have the ability to feed on bacteria and treat cancer which can treat diseases effectively.People began to pay more attention to the potential application of phage in disease treatment.This paper researched on the recent progress, the practical application, advantages and disadvantages of phage treatment, etc.Key word：phage; bacteria; cancer; therapy噬菌体准确的名称应该是细菌病毒，噬菌体分为烈性噬菌体及温和性噬菌体,前者可在敏感宿主菌内增殖,并使之裂解,亦称为毒性噬菌体。
铜绿假单胞菌的分类鉴定
微生物学检验
检验程序
脓液 痰 尿液等
分离培养Βιβλιοθήκη 直接涂片、革兰染色、镜检（血平板、麦康凯）
35℃ 18-24h
可疑菌落（金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味）
初步鉴定
革兰阴性 杆菌，氧 化酶阳性
菌落特征 气味 绿脓素
最终鉴定
色素 鉴定
生化 反应
42℃ 生长
分型 （血清学
噬菌体）
药敏试验
报告
试验材料
初步鉴定
选出可疑菌落
金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味等
初步鉴定
➢染色镜检：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。 ➢氧化酶试验：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一 滴新配制的5%二甲基对苯二胺试剂，15-30min内， 出现红色至紫红色，为阳性；若不变色，为阴性。
初步鉴定
➢绿脓菌素试验：选取可疑菌落2-3个，置于绿脓菌 素测定用培养基，于37℃培养24h，加入氯仿、色素 后，再加入盐酸 ，上层稀盐酸液内出现红色为阳性， 表示菌落中含有绿脓菌素。
最终鉴定
明胶液化试验：选取可疑菌落的纯培养物，穿刺 接种于明胶培养基内，37℃培养24h，取出后放入 冰箱10-30min，如若溶解，即试验呈阳性；如凝固 不溶，试验呈阴性。 硝酸盐还原试验：选取可疑菌落的纯培养物，接 种于硝酸盐培养基，置于37℃培养24h，如若培养 基中的小倒管内有气体，试验呈阳性。
最终鉴定
吲哚试验：选取可疑菌落的纯培养物接种于蛋白胨 水，培养8h-24h后，加Kovacs（靛基质）试剂约3mm 高，如若在液层界面发生红色，即为阳性反应。 42℃生长试验：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜 面培养基上，于42℃培养4h，铜绿假单胞菌能生长为 阳性反应。
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性杆菌。
它是一种多重耐药的病原菌，对众多常用抗菌药物表现出不同程度的耐受性。
鉴定铜绿假单胞菌的方法及技术的进展对于临床医学、环境卫生以及食品安全等领域具有重要意义。
一、传统鉴定方法1. 形态学特征：铜绿假单胞菌在常规琼脂平板上生长呈青绿色，细菌呈短杆状或不规则杆状，革兰染色呈阴性，不产生孢子。
2. 生理和生化特性：铜绿假单胞菌可利用较多种类的碳源生长，产生草酸酶、葡萄糖氧化酶等酶类。
此外，它还可产生金黄色脆忻素、绿色芽孢杆菌素等色素。
3. 血清学鉴定：通过血清学反应检测铜绿假单胞菌所产生的O抗原和Vi抗原，结合凝集试验、血凝试验等方法进行鉴定。
二、分子生物学鉴定方法随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法被用于铜绿假单胞菌的鉴定和检测。
1. 16S rRNA基因测序：16S rRNA基因是细菌共有的基因，在物种鉴定上具有较高的特异性和可溯源性，通过对铜绿假单胞菌菌株进行16S rRNA基因测序，可以快速准确地鉴定其物种。
2. 基因片段PCR：利用铜绿假单胞菌特异基因片段进行PCR扩增，如oprL基因、oprD基因等，通过特异性条带出现可以判断是否为铜绿假单胞菌。
3. 多重PCR技术：多重PCR技术可以通过扩增多个特异基因片段，提高检测的特异性和灵敏度，如gyrB、rpoB、27-kDa等基因片段。
三、质谱法质谱法是近年来快速进行菌种鉴定的一种方法，其应用已得到广泛推广。
主要有飞行时间质谱法、荧光定量PCR结合质谱法、表面增强激光解析电离质谱法等。
这些质谱方法可以通过菌株代谢产物的分子质量进行鉴定。
四、胶体金技术胶体金技术通过标记特异性抗体或引物，利用胶体金颗粒作为信号素，通过胶体溶液在酶或免疫检测中的特异性反应，可以高度敏感地鉴定铜绿假单胞菌。
五、纳米生物传感器纳米生物传感器是一种新兴的鉴定技术，通过利用纳米材料的特殊性质以及生物传感机制来实现铜绿假单胞菌的高灵敏度检测。
多重耐药铜绿假单胞菌
不一样株进行同源性分析一个方法。依据细菌 携带质粒情况进行分析。
多重耐药铜绿假单胞菌
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四、铜绿假单胞菌耐药机制
（铜绿假单胞菌耐药机制异常复杂，总括之，主要与以下原 因相关：
①细菌产生抗菌活性酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等
②细菌改变抗菌药品作用靶位，如青霉素结合蛋白(PBPs)、 DNA旋转酶等结构发生改变，从而逃避抗菌药品抗菌作用 。
多重耐药铜绿假单胞菌
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六、铜绿假单胞菌研究进展及预防控 制
铜绿假单胞菌在医院感染中常见，并存在严重 耐药性及多药耐药性，其主要耐药机制是产生 各种灭活或修饰酶、菌体蛋白结构和功效改变 、膜屏障与主动外排、生物膜形成等。
多重耐药铜绿假单胞菌
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六、铜绿假单胞菌研究进展及预防控 制
铜绿假单胞菌感染已经成为临床治疗一个难点，控制泛
耐药铜绿假单胞菌泛滥，详细办法以下：（1）严格控 制三、四代头孢抗菌药品用药指征（每日查抗菌药品使 用病例）。（2）碳青霉烯类抗菌药品使用需由两名特 殊抗菌药品教授会诊同意后方可使用。降低传输：每日 LIS系统监测全院耐药菌产生，一旦发觉泛耐药铜绿假 单胞菌，马上通知临床执行接触隔离：（1）将患者单 间隔离。（2）病房贴蓝色接触隔离标识。（3）医务人 员及护工、家眷均严格执行手卫生，穿隔离衣。（4） 诊疗用具单人单用。（5）加强环境清洁消毒，每日两 次“84”消毒液进行物体表面及地面擦拭。
单环类抗生素代表氨曲南有抗铜绿假单胞菌活性，但较弱，临床疗效有限，仅适 合用于轻、中度感染。
多重耐药铜绿假单胞菌
第22页
五、治疗方案
细菌生物膜(biofilm)在铜绿假单胞菌感染中广泛存在， 是造成抗菌治疗失败主要原因之一。大环内酯类抗生 素本身几乎没有抗铜绿假单胞菌活性，但能抑制生物 膜形成，调整免疫，增强吞噬细胞吞噬作用，抑制铜 绿假单胞菌一些毒性因子而增强其它抗铜绿假单胞菌 药品活性，改进疗效。研究发觉，红霉素、克拉霉素 、阿奇霉素和罗红霉素能有效抑制生物膜形成，短期 联合头孢他啶等抗铜绿假单胞菌药品后就可显著改进 临床疗效(如克拉霉素5d方案)，其中以阿奇霉素抑制 作用最强。
铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究
铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugonosa）在医学上称为绿脓杆菌。
该菌具有极强的环境适应能力和对多种抗生素的耐受能力。
对于人体，绿脓杆菌是最重要的条件致病菌，是创伤、烧伤及免疫受损机体最容易感染的细菌之一，严重地危害着人类的健康与生命。
噬菌体（Bacteriophage）是细菌的病毒，它与宿主菌关系密切。
一方面，溶原性噬菌体通过自身携带的外源性遗传物质改变宿主菌的生物学性状，同时，在与宿主菌基因组不断地重组、整合、转座和切离过程中彼此交换遗传物质，影响宿主菌及自身基因的多样性，成为除质粒之外的一股重要基因流（genestream），在生物之间介导着基因的水平转移（horizontal transfer）；另一方面，基于裂菌性噬菌体能特异性裂解宿主菌，也基于如果诱导前噬菌体进入裂菌性生长周期就可导致细菌裂解，噬菌体有望发展成为抗细菌感染的生物制剂。
不管是想研究噬菌体与细菌间相互作用关系，揭示噬菌体介导的基因水平转移所导致的生物多样性等重大问题，还是研究噬菌体的工程改造和噬菌体治疗，都需要对噬菌体及其宿主菌的遗传学背景有极清楚的认识。
最近，绿脓杆菌PA01菌株全基因组测序工作已完成，而绿脓杆菌噬菌体的基因组研究工作的积累仍非常有限。
为此，本研究以绿脓杆菌为宿主菌，成功分离了3株新的噬菌体，对其中两株（一为溶原性噬菌体，一为裂菌性噬菌体，二者具有一相同的宿主菌）展开了全基因组测序。
井对已完成测序的PaP3展开了基因组学研究和某些基因功能的研究。
主要内容及实验结果包括以下几方面： 1．以绿脓杆菌临床分离株为宿主菌，从医院下水道污水中分离到3株绿脓杆菌噬菌体，分别命名为 PaPI、PaPZ和 PaP3。
其中 PaPI是裂菌性噬菌体，PaPZ和PaP3是溶原性噬菌体；电镜结果表明PaPI为有尾噬菌体，PaPZ、PaP3为短尾噬菌体；按国际上分类标准，PaPI属肌尾噬茵体科m），PaPZ和PaP3属短尾噬菌体科（Pedoviridae）；三株均为双链DNA噬菌体。
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铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于环境中的革兰阴性杆状细菌，对人类和动物的健康带来了重要的威胁。
铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，特别是对免疫力低下的人群和患有囊性纤维化等疾病的患者来说，可能导致严重的感染和疾病。
噬菌体是一种专门感染细菌的病毒，可以促进细菌的快速寄主扩增和传播。
利用噬菌体进行铜绿假单胞菌的分离鉴定可以帮助我们更好地了解该菌株的特性和基因组信息。
铜绿假单胞菌噬菌体的分离可以通过环境样品的筛选和处理进行。
首先，我们可以收集不同环境中的样品，如土壤、水、医院洗手间等。
接下来，将采集到的样品进行取样，在无菌条件下进行菌落分离和培养。
将提取到的细菌溶菌液与靶菌进行混合培养，并在相关培养基上选择呈现清晰的菌落。
分离到的铜绿假单胞菌噬菌体可以进行鉴定。
通过电镜观察噬菌体的形态特征，如头部形状、基质的尾部形状等，可以初步判断其属于铜绿假单胞菌噬菌体。
进一步，可以通过传统的形态学特征结合分子生物学方法进行鉴定。
例如，进行噬菌体DNA的提取并使用PCR扩增常见的噬菌体基因，如大头蛋白基因和小头蛋白基因，进行测序和比对，以确定其属于铜绿假单胞菌噬菌体。
铜绿假单胞菌噬菌体的基因组学研究可以帮助我们深入了解其功能和特性。
首先，可以进行整个噬菌体基因组的测序和组装，以获取其完整的基因组序列。
这可以通过先进行高通量测序获取大量噬菌体DNA，然后使用生物信息学工具将测序得到的短序列片段组装成完整的基因组。
基因组学研究还可以揭示铜绿假单胞菌噬菌体的基因组结构特征，如基因数量、基因功能和组织方式等。
通过对基因组的分析，我们可以预测噬菌体的宿主范围和寄主特异性。
此外，基因组数据还可以为进一步研究噬菌体的功能基因和适应性基因提供线索，例如毒力相关因子和耐药基因等。
此外，基因组学研究还可以帮助我们了解铜绿假单胞菌噬菌体的进化历程和遗传变异。
通过比较不同铜绿假单胞菌噬菌体基因组的异同，我们可以探索其进化关系和遗传多样性，为铜绿假单胞菌的生态适应性和宿主适应性提供更深入的理解。
总结起来，铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究可以帮助我们更好地了解该菌株的特性和基因组信息，为进一步研究其功能和适应性提供基础。
这对于预防和控制铜绿假单胞菌感染以及开发相关的抗菌治疗方案具有重要意义。