噬菌体抗体淘筛方法
噬菌体抗体库筛选技术研究进展 - 文章编号1007-8738(2005)S-0058
[ 1 ] W illats W G. Phage disp lay: p racticalities and p rospects [ J ]. P lant M ol B iol, 2002, 50 ( 6) : 837 - 854.
[ 2 ] Ladner RC. Phage disp lay and pharmacogenom ics [ J ]. Pharm acog2 enom ics, 2000, 1 ( 2) : 199 - 202.
收稿日期 : 2004 - 03 - 22; 修回日期 : 2004 - 05 - 08 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No. 30371399) 作者简介 : 薛国柱 (1966 - ) , 男 , 河南新野人 , 副主任医师 , 博士生.
Tel: ( 29) 83375259; Email: xgzh2003@ yahoo. com. cn
噬菌体 抗 体 库 的 筛 选 包 括 两 个 主 要 步 骤 : 淘 筛 和 鉴 定 [5 ] 。淘筛 (panning)是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共 同孵育 , 通过几轮洗脱 , 收集结合的噬菌体 。将获得的噬菌 体感染细菌并扩增 , 再进行下一轮的淘筛 。经几轮淘筛后 , 便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株 。 鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌 株 。即将淘筛出的噬菌体感染细菌 、铺板 、挑选 , 即可得到 高特异性单克隆菌株 。
由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同 , 对未 知抗原的分离鉴定有很大困难 , 因而在很长一段时间内抗体 库没有被用于对肿瘤特异性抗体的筛选 [11 ] 。最近 , 直接用肿 瘤细胞从单链噬菌体抗体库中筛选肿瘤特异性抗体已有报 道 。如 Kup sch等 [12 ]筛选出与黑色素瘤细胞特异性结合的抗 体 。R idgway等 [13 ]采用先将正常支气管上皮细胞系与非特异 性的噬菌体抗体清除后 , 再用肺腺癌细胞系进行筛选的方法 , 得到抗 CD55的单链抗体 。但即使这样 , 其筛选效率仍较低 , 而且容易丢失亲和性高的噬菌体 。 Siegel等报道了磁性细胞 分离法 (magnetically2activated cell sorting, MACS) 。即用抗原 阳性的细胞包裹磁珠 , 然后与大量抗原阴性的细胞混合 , 加 入待筛选的噬菌体作用后 , 再通过磁柱快速分离结合特异性 噬菌体的抗原阳性细胞 。他们采用 MACS法 , 以人血红细胞 Rh (D ) +细胞为靶细胞 , Rh (D ) - 细胞吸收非特异性噬菌体 , 成功地从 Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列抗 Rh (D)的抗体。
抗体筛选鉴定推荐流程
抗体筛选鉴定推荐流程抗体筛选鉴定推荐流程：1.包被免疫管：将100ug 抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度过夜孵育。
2.封闭：将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体500ul 加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。
同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。
3.抗原和噬菌体孵育：将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。
将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。
4.清洗：将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。
5.洗脱：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL 的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。
6.ELISA鉴定：将上一步筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后，取100ul加入到OD600为0.5的SS320菌液中，37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上，37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上，37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30度过夜培养。
第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。
将过夜包被抗原和用3%BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。
用含有0.05%吐温的PBS清洗3次后，用噬菌体抗体抗体作为一抗，用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。
选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列。
抗体筛选技巧：1. 合适量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水亲水性质、结构有关，也和包被缓冲液和包被介质的选择有关，合理的包被是成功筛选的基础，如果有必要可以进行预实验确定包被的条件。
噬菌体抗体淘筛方法
这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。
由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。
在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。
这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。
这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。
TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。
我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。
使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。
3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。
分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。
用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。
通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。
6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。
抗噬菌体菌株筛选
抗噬菌体菌株筛选噬菌体的分离取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。
在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。
取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
噬菌体的纯化与增殖将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。
取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml，混匀后加在生产菌株的平57板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。
最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。
噬菌体效价的测定取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，各加入0.9 ml无菌蒸馏水。
在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得6个稀释度的噬菌体稀释液。
在5支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50℃的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。
抗噬菌体菌株选育步骤噬菌体抗性的检测将上述经过诱变和加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液0.5 ml涂布到生产菌株的平板培养基上，表面干燥后加入0.1 ml保存的噬菌体原液，涂布均匀后置适温下培养48~72 h，观察噬菌斑的形成并计数(如无噬菌体原液，也可用噬菌斑制成悬浮液)。
噬菌体展示筛选抗体技术介绍
探索生物医学中的创新应用
目录
01 噬菌体展示筛选抗 体概述
06 噬菌体展示抗体的 发展前景
02 噬菌体展示技术原 理
03 噬菌体展示抗体筛 选流程
0Hale Waihona Puke 噬菌体展示抗体的 应用案例05 噬菌体展示抗体的 优点与缺点
01 噬菌体展示筛选抗体 概述
噬菌体展示筛选抗体概述
1 噬菌体展示筛选抗体技术介绍
疗效果并降低副作用。
05 噬菌体展示抗体的优 点与缺点
噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术能够快速、 高效地筛选出特异性抗体， 大大缩短了实验周期，提高 了研究效率。
噬菌体展示抗体的局 限性
噬菌体展示技术虽然筛选速 度快，但存在假阳性率高的 问题，需要进一步的验证和 优化。
噬菌体展示筛选抗体技术是一种利用噬菌体表面
噬菌体展示筛选抗体的优势 2 展示特定蛋白质，通过生物淘选方法寻找与目标
噬菌体展示筛选抗体技术具有高度灵活性和多样
抗原特异性结合的抗体的方法。
性，能够快速、高效地筛选到具有高亲和力和特
异性的抗体，为免疫学研究和药物开发提供了重
要工具。 3 噬菌体展示筛选抗体的应用前景
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术具有高度灵 活性和多样性，可以快速、 大量地筛选出特异性强、亲 和力高的抗体，为生物医学 研究和药物开发提供了重要 工具。
噬菌体展示抗体的应 用前景
噬菌体展示抗体技术在肿瘤 治疗、免疫诊断、疫苗研发 等领域具有广泛应用前景， 有望为人类健康事业做出重 要贡献。
谢谢大家
噬菌体展示筛选抗体技术在疾病诊断、治疗和预
防等方面具有广泛的应用前景，包括癌症治疗、
噬菌体抗体文库淘选
噬菌体抗体文库淘选1.主要实验仪器表1实验所用主要仪器仪器名称型号/厂家高速冷冻离心机Neofuge15R生物安全柜Heal Force电热恒温水浴锅HHW21.600AⅡ恒温培养箱Heal force（3）5ml5%脱脂牛奶/PBST30℃封闭1h。
（4）5ml PBS洗涤1次。
（5）每管中加入500ul，10^11-10^12pfu的文库噬菌体（或者上一轮的扩增噬菌体），30℃孵育2h。
（6）5ml PBST洗涤4-6次(后几轮可根据富集程度增加洗涤次数）。
（7）每管中加入500ul的Gly-HCl（pH=2.2）洗脱噬菌体，室温振荡孵育6-8min左右。
加入120-130ul的Tris-HCl(pH=9.6)中和溶液至pH=7.0-8.0。
（8）将洗脱后的噬菌体稀释后，侵染对数期的大肠杆菌TG1，铺板测定滴度。
3.2洗脱噬菌体的扩增（1）吸取洗脱后的噬菌体，加入到对数期的大肠杆菌TG1菌液中，37℃静置30min后，220rpm培养30min-1h。
（2）培养基中加入抗生素Amp，37℃，220rpm培养至菌液OD=0.4-0.6左右。
（3）在菌液中加入辅助噬菌体。
37℃静置30min后，220rpm培养45min-1h。
（4）3000-5000rpm离心菌液，弃上清。
用同等体积2YT-Amp-Kan培养基重悬菌体。
30℃，220rpm培养过夜。
（5）次日，8000rpm，4℃，20min离心菌液，将上清转入新的离心管中。
加入1/4体积的（4）用PBS稀释每一轮扩增后的噬菌体，稀释倍数3倍递增。
初始浓度为10^12pfu/ml。
每孔中加入100ul稀释后的扩增噬菌体。
30℃孵育1h，300ul PBST洗涤4-6次。
（5）加入100ul二抗（抗噬菌体M13）稀释液，30℃孵育1h，300ul PBST洗涤4-6次。
（6）加入100ul显色液TMB避光显色3-8min，加入100ul2M HCl终止反应，酶标仪读数（450nm-620nm）。
噬菌体展示文库的筛选技术 2005
噬菌体展示文库的筛选技术李丽芳 张映(山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)摘 要: 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PD T )是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。
该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。
但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。
关键词: 噬菌体 肽库 抗体库 筛选The Selection T echniques of Phage Display LibrariesLi Lifang Zhang Y ing(A ni mal S cience and Technolog y Depart ment of S hanx i A g ricult ure Universit y ,S hanx i Tai gu 030801)Abstract : Phage Display Techniques (PD T )is a biotechnique used for screening and reconstructing functingal polypeptide.It ,s a effective method of select the peptide which has high affinities to many given targets (such as an 2tibody ,Enzyme ,surface receptor of cell ).It has been made much progress and are widely used in many fields ,such as genetic treatment ,the study of genetic vaccine ,epitope mapping ,drug discovery after its appearance.But it has to get more perfact in two sides :(1)Seek more effective expression vector ;(2)G et more perfect selection methods.Many selection methods are reviewed in this article.K ey words : Phage Peptide library Antibody library Selection 噬菌体表面展示技术是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。
噬菌体抗体淘筛方法
噬菌体抗体淘筛方法一、噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术基于噬菌体颗粒表面的基因插入法。
通过将抗体片段的基因插入到噬菌体基因组中，使噬菌体能够在其表面展示抗体。
随后，将含有目标抗原的库经过一系列的筛选步骤，如淘洗、洗涤和分离，以筛选出与目标抗原特异性结合的抗体。
噬菌体核心蛋白质pIII等表面蛋白链通过基因插入的方法与外源基因连接，实现抗原展示。
二、噬菌体抗体淘筛方法的流程1.抗原制备：首先，需要制备目标抗原。
可以通过多种方法制备抗原，如重组蛋白表达系统、细胞和细胞溶解物、组织和分离物等。
2.抗体库构建：构建包含大量抗体片段的抗体库。
一般使用转录组或基因组DNA作为起始材料，使用PCR扩增抗体基因片段，并将其插入合适的载体中。
3.噬菌体包装：将构建好的抗体库与噬菌体粒子一起包装成噬菌体颗粒。
4.抗原吸附：将噬菌体抗体库与目标抗原进行反应，使抗体与抗原结合。
5.淘洗分离：用洗涤缓冲液对混合物进行混洗，以除去非特异性结合的噬菌体。
6.噬菌体放大：将经过淘洗分离的噬菌体在培养基中进行放大培养。
7.ELISA筛选：使用ELISA检测噬菌体是否与目标抗原的特异结合。
将阴性和阳性对照样品和待测样品加入到蛋白质包被的酶标板孔中，通过检测酶标物质的生成或反应物颜色的变化，判断噬菌体是否与目标抗原结合。
8.质粒DNA提取和测序：选择特异性结合抗原的噬菌体进行质粒DNA 提取和测序，以获取抗体的DNA序列。
9.后续鉴定和分析：鉴定筛选出的抗体的亲和力、特异性、敏感性等性质，以及进行进一步的功能分析。
三、噬菌体抗体淘筛方法的注意事项1.抗原的选择：选择合适的抗原非常关键，抗原应具有特异性且容易从培养基或生物样品中提取。
2.抗体库的构建：构建抗体库时，要确保插入的抗体片段多样性和覆盖性。
3.抗原吸附条件的优化：抗原吸附条件的优化对淘洗分离步骤的效果具有重要影响。
4.筛选条件的优化：在ELISA筛选过程中，需要对反应温度、时间、缓冲液浓度等条件进行优化，以提高筛选效果。
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这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。
由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。
在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。
这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。
这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。
TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。
我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。
使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。
3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。
分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。
用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。
通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。
6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。
（1.5-2小时）7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。
8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。
In advance准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理）在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作Steps ProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of libraries第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体B1和B3 制作文库的第二原种Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selection第二天A7-A12 增殖文库I和J，并且制备噬菌体C1 包被第一轮筛选用免疫管Day 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selection第三天C2-C11 第一轮筛选Day 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selection第四天D1-D6 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selection第五天D7-D11 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第二轮筛选Day 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selection第六天D1-D6 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selection第七天D7-D11 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第三轮筛选Day 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISA第八天D1-D6 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体E1 包被多克隆噬菌体ELISA用的96孔板Day 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISA第九天D7-D11 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）E2-E8 多克隆噬菌体ELISA每个克隆的进一步的描述可以通过单克隆噬菌体ELISA（方案E），单克隆噬菌体ELISA用水溶性的scFv 片段（方案F）。
PCR检测（检测插入，方案H）和测序（方案I）1. 将文库的加入到200ml预热的含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基上2. 37°C振荡培养至OD 600为0.43. 从中取50ml，加入2x1011 KM13辅助噬菌体（剩余的150ml在方案B中用来制备文库的第二细菌储存液）4. 37°C水中温浴30分钟5. 3000g,离心10min,用100ml含有100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml的卡那霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基6. 30度振荡过夜培养7. 将过夜产物在3300g离心30分钟8. 取上层液体80ml，加入20mlPEG/NACL(含20 % PEG，2.5 M NaCl)溶液9. 3300g离心30分钟，倒掉PEG/NACL溶液，重新离心，吸去剩余的PEG/NACL溶液10 用4mlPBS缓冲液悬浮沉淀，11600g离心10分钟，去掉任何剩余的细菌残渣11. 短期使用的话可以保存在4℃，长期保存的话置于含有15%甘油的PBS中，-70℃保存。
12. 将噬菌体稀释100倍，然后继续稀释至6个浓度，加入900μl OD 600 为0.4的TG1至每一个管中，37°C水浴30min,取每个稀释浓度的10μl加入到TYE培养基上，其中包含100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖，37摄氏度过夜培养。
浓度在1012-1013/ml，至少可以进行10次筛选1．将A3步骤中剩余的150ml液体，37摄氏度下振荡培养2小时2、10800g离心10分钟，用10ml含有15%甘油的2xTY悬浮3、每管500微升，分装20管，保存于-70℃。
每次制备的时候用其中一管。
这个仅限于你打算做超过10次筛选的时候。
或者，噬菌体可以用生物素酰化的抗原或者亲和层析来完成1、用目的抗原4ml过夜来包被免疫管。
包被的效率取决于抗原的浓度，温度和缓冲液，通常用抗原浓度10-100 μg/ml的PBS缓冲液。
2. 第二天用PBS缓冲液洗三次（倒入管内，然后马上倒出来）3. 用含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液注满管子，室温下孵化，置于工作台上两个小时候停止4. 用PBS缓冲液洗管3次5. 将1012- 1013噬菌体键入到4ml的含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液。
室温下旋转培养孵育60分钟，然后静止培养60分钟，弃掉上清液6. 用含有0.1%的吐温20的磷酸缓冲液洗管子10-20遍7. 甩干多余的PBS缓冲液，用含有50 μl of 10mg/ml胰蛋白酶的磷酸缓冲液500微升稀释噬菌体，用可翻滚的摇床室温培养10min.8. 取1.5mlOD值为0.4的大肠杆菌TG1，加入250 μl稀释后的噬菌体（剩余的4°C保存），37℃水浴30min..9. 吸取液体，及稀释100倍的，和稀释10000倍的溶液各10微升，加到含有100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上，37度过夜培养来测定噬菌体10、第一轮筛选时如果用复合抗原，取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。
将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。
如果用的是单个的半抗原，糖类或者蛋白质抗原及所有抗原的下面的步骤：取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。
将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。
11. 37°C过夜培养第一轮的筛选是最重要的。
任何的错误都会导致以后的错误。
每轮结束后最少能够得到100个火星的噬菌体，如果少于这个数量，说明可能出现了错误。
所以，试着用新鲜的TG1感染剩余的250ml噬菌体，如果这一步仍然少于100噬菌体，从C1开始重复筛选。
1. 过夜增殖以后，加7ml含有15%甘油的2 xTY到large square Bio-Assay dish或者加2ml到常规的培养皿，然后用玻璃涂布器松散细胞，彻底混匀。
将得到的50 μl细菌接种到50 ml包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的2xTY中。
剩余的1ml保存在15%的甘油中，-70°C保存。
2. 振荡培养至OD600为0.43. 取10ml培养物，加入5x1010辅助噬菌体4 37°C水浴30min5. 3000g离心10分钟。
用含有50 ml包含100 μg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY悬浮6. 30°C振荡培养过夜7. 将过夜产物3300g离心10分钟8. 加入10ml PEG/NaCl (20 % PEG 6000, 2.5 M NaCl)至40ml上清液。