噬菌体抗体淘筛方法
噬菌体抗体库几种筛选方法的比较
噬菌体抗体库几种筛选方法的比较
王刚;刘玉峰;王琰;化冰
【期刊名称】《第四军医大学学报》
【年(卷),期】2001(22)16
【摘要】目的对多种不同的噬菌体抗体库筛选方法进行比较研究. 方法应用抗原固相化吸附筛选法、生物素化抗原液相筛选法和解离速率筛选法对半合成噬菌体抗体库或轻链替换库进行抗角蛋白噬菌体抗体的筛选,比较各自的筛选效率和优缺点. 结果 3种方法筛选抗角蛋白抗体均获成功,抗原固相化吸附筛选法效果可靠,所获抗体特异性高但抗原消耗量大;生物素化抗原液相筛选法方法敏感且节省抗原,可以根据实验目的和抗体库性质灵活调节筛选体系,其不足是筛选获得的克隆中容易出现非特异性结合的克隆;而解离速率筛选是选择性获得高亲和力抗体的有效手段. 结论不同的筛选策略各具优势,在实际应用中可根据不同的实验目的选择相应的筛选方法.【总页数】3页(P1482-1484)
【作者】王刚;刘玉峰;王琰;化冰
【作者单位】第四军医大学西京医院皮肤科,;第四军医大学西京医院皮肤科,;海军总医院中心实验科,;海军总医院中心实验科,
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.两种不同噬菌体筛选方法所获的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位抗原性比较 [J], 雷家慧;姜昌富;李天群
2.抗人B型钠尿肽噬菌体抗体库的构建及噬菌体抗体的筛选 [J], 刘世明;李民友;钟赟;吴楚财
3.噬菌体抗体库分类与筛选方法的研究 [J], 张媛;常思源
4.噬菌体抗体库筛选方法的研究进展 [J], 张青;郝晓柯;苏明权
5.从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体(摘要) [J], 王志毅;刘杞;万泽生;张定凤
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噬菌体抗体库筛选技术研究进展 - 文章编号1007-8738(2005)S-0058
[ 1 ] W illats W G. Phage disp lay: p racticalities and p rospects [ J ]. P lant M ol B iol, 2002, 50 ( 6) : 837 - 854.
[ 2 ] Ladner RC. Phage disp lay and pharmacogenom ics [ J ]. Pharm acog2 enom ics, 2000, 1 ( 2) : 199 - 202.
收稿日期 : 2004 - 03 - 22; 修回日期 : 2004 - 05 - 08 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No. 30371399) 作者简介 : 薛国柱 (1966 - ) , 男 , 河南新野人 , 副主任医师 , 博士生.
Tel: ( 29) 83375259; Email: xgzh2003@ yahoo. com. cn
噬菌体 抗 体 库 的 筛 选 包 括 两 个 主 要 步 骤 : 淘 筛 和 鉴 定 [5 ] 。淘筛 (panning)是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共 同孵育 , 通过几轮洗脱 , 收集结合的噬菌体 。将获得的噬菌 体感染细菌并扩增 , 再进行下一轮的淘筛 。经几轮淘筛后 , 便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株 。 鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌 株 。即将淘筛出的噬菌体感染细菌 、铺板 、挑选 , 即可得到 高特异性单克隆菌株 。
由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同 , 对未 知抗原的分离鉴定有很大困难 , 因而在很长一段时间内抗体 库没有被用于对肿瘤特异性抗体的筛选 [11 ] 。最近 , 直接用肿 瘤细胞从单链噬菌体抗体库中筛选肿瘤特异性抗体已有报 道 。如 Kup sch等 [12 ]筛选出与黑色素瘤细胞特异性结合的抗 体 。R idgway等 [13 ]采用先将正常支气管上皮细胞系与非特异 性的噬菌体抗体清除后 , 再用肺腺癌细胞系进行筛选的方法 , 得到抗 CD55的单链抗体 。但即使这样 , 其筛选效率仍较低 , 而且容易丢失亲和性高的噬菌体 。 Siegel等报道了磁性细胞 分离法 (magnetically2activated cell sorting, MACS) 。即用抗原 阳性的细胞包裹磁珠 , 然后与大量抗原阴性的细胞混合 , 加 入待筛选的噬菌体作用后 , 再通过磁柱快速分离结合特异性 噬菌体的抗原阳性细胞 。他们采用 MACS法 , 以人血红细胞 Rh (D ) +细胞为靶细胞 , Rh (D ) - 细胞吸收非特异性噬菌体 , 成功地从 Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列抗 Rh (D)的抗体。
抗体筛选鉴定推荐流程
抗体筛选鉴定推荐流程抗体筛选鉴定推荐流程：1.包被免疫管：将100ug 抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度过夜孵育。
2.封闭：将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体500ul 加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。
同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。
3.抗原和噬菌体孵育：将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。
将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。
4.清洗：将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。
5.洗脱：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL 的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。
6.ELISA鉴定：将上一步筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后，取100ul加入到OD600为0.5的SS320菌液中，37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上，37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上，37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30度过夜培养。
第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。
将过夜包被抗原和用3%BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。
用含有0.05%吐温的PBS清洗3次后，用噬菌体抗体抗体作为一抗，用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。
选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列。
抗体筛选技巧：1. 合适量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水亲水性质、结构有关，也和包被缓冲液和包被介质的选择有关，合理的包被是成功筛选的基础，如果有必要可以进行预实验确定包被的条件。
从大容量噬菌体抗体库中筛选抗体
将所分析得到的抗原性高的基因序列进行 ＢＬＡＳＴ比 对。选取抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片 段进行表达。 １．２．２ 细胞培养 ＨｅＬａ细胞以 １×１０５接种于含 １０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液中，５％ＣＯ２／９５％空气，３７℃ 孵育培养。 １．２．３ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ?ＰＣＲ 收集指数生长期细 胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总 ＲＮＡ。定量后，Ｍ?ＭＬＶ逆转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链。以反转录获得的 ｃＤＮＡ为模板，分别用 两对引物 Ｐ１，Ｐ２和 Ｐ３，Ｐ４对目的基因片段进行 ＰＣＲ扩 增。扩增反应的条件均为：９５℃预变性 １０ｍｉｎ，９４℃变 性 ４５ｓ，５５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，扩增 ３０个循环。 ＰＣＲ扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 １．２．４ 重组克隆载体 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ４ 的构建与鉴定 将纯化的两段 ＰＣＲ产物分别连入载体 ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙ，构建重组质粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，转化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后 挑 取 阳 性 克 隆，用 ＮｄｅⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 质 粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，将两段目的基因片段分别回收纯化。 １．２．５ 重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 的构建与诱导表达 将纯化的两段目的基因与经 Ｎｄｅ Ⅰ ／ＸｈｏⅠ双酶切的载体 ｐＥＴ?２２ｂ（ ＋ ）相连接，分别 构建重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４，转 化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后挑取阳性克隆，用 ＮｄｅⅠ ／Ｘｈｏ Ⅰ双酶切鉴定。经测序分析正确的重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ? ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 转 化 感 受 态 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取阳性克隆，接种于 １０ｍｌＬＢ／Ａｍｐ＋培养基 中，于 ３７℃培 养 过 夜。按 １％ 比 例 将 工 程 菌 转 接 于 ５００ｍｌ新鲜的 ＬＢ／Ａｍｐ＋培养基中，３７℃培养至 ＯＤ６００约 ０．５时，加 入 终 浓 度 为 ０．８ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱 导 表，于 ３７℃培养 ３ｈ。表达产物用 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ检测。取 ５０ｍｌ 经诱导表达 的 工 程 菌 超 声 裂 解 后，分 别 取 上 清 组 分 及 沉淀组分 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分析。 １．２．６ 融合蛋白 ＤＰＫ３和 ＤＰＫ４的纯化 收获的工程 菌经超声破菌后，将沉淀物用 １％ ＴｒｉｔｏｎＸ?１００漂洗后 用缓冲液 Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ７．５）于 ４℃洗涤 ２ｈ，离心收集沉淀。经粗提的包涵体溶解于 缓 冲 液 Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ８．０， ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），４℃搅拌 ２ｈ，使其充 分溶解。离心后取上清以 １ｍｌ／ｍｉｎ的流速上样于经缓 冲液 Ｂ平衡后的 ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱，上样后以缓冲液 Ｂ洗 柱；而 后 通 过 梯 度 混 合 器 形 成 从 缓 冲 液 Ｂ到 Ｃ
噬菌体抗体淘筛方法
这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。
由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。
在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。
这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。
这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。
TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。
我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。
使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。
3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。
分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。
用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。
通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。
6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。
噬菌体抗体文库淘选
噬菌体抗体文库淘选1.主要实验仪器表1实验所用主要仪器仪器名称型号/厂家高速冷冻离心机Neofuge15R生物安全柜Heal Force电热恒温水浴锅HHW21.600AⅡ恒温培养箱Heal force（3）5ml5%脱脂牛奶/PBST30℃封闭1h。
（4）5ml PBS洗涤1次。
（5）每管中加入500ul，10^11-10^12pfu的文库噬菌体（或者上一轮的扩增噬菌体），30℃孵育2h。
（6）5ml PBST洗涤4-6次(后几轮可根据富集程度增加洗涤次数）。
（7）每管中加入500ul的Gly-HCl（pH=2.2）洗脱噬菌体，室温振荡孵育6-8min左右。
加入120-130ul的Tris-HCl(pH=9.6)中和溶液至pH=7.0-8.0。
（8）将洗脱后的噬菌体稀释后，侵染对数期的大肠杆菌TG1，铺板测定滴度。
3.2洗脱噬菌体的扩增（1）吸取洗脱后的噬菌体，加入到对数期的大肠杆菌TG1菌液中，37℃静置30min后，220rpm培养30min-1h。
（2）培养基中加入抗生素Amp，37℃，220rpm培养至菌液OD=0.4-0.6左右。
（3）在菌液中加入辅助噬菌体。
37℃静置30min后，220rpm培养45min-1h。
（4）3000-5000rpm离心菌液，弃上清。
用同等体积2YT-Amp-Kan培养基重悬菌体。
30℃，220rpm培养过夜。
（5）次日，8000rpm，4℃，20min离心菌液，将上清转入新的离心管中。
加入1/4体积的（4）用PBS稀释每一轮扩增后的噬菌体，稀释倍数3倍递增。
初始浓度为10^12pfu/ml。
每孔中加入100ul稀释后的扩增噬菌体。
30℃孵育1h，300ul PBST洗涤4-6次。
（5）加入100ul二抗（抗噬菌体M13）稀释液，30℃孵育1h，300ul PBST洗涤4-6次。
（6）加入100ul显色液TMB避光显色3-8min，加入100ul2M HCl终止反应，酶标仪读数（450nm-620nm）。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来,细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。
它从根本上了改变了传统的单抗制备流程(杂交瘤技间接术)，宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。
随着该技术的不断发展,继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术.这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。
抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。
那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库.图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态,根据出现时间的先后,主要分为经典筛选法和新型筛选法。
1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。
固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。
如此反复筛选数次,可得到高亲和性的噬菌体.这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合.2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况,需要开发新的筛选方法。
目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。
细胞筛选法:细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。
噬菌体抗体淘筛方法
噬菌体抗体淘筛方法一、噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术基于噬菌体颗粒表面的基因插入法。
通过将抗体片段的基因插入到噬菌体基因组中，使噬菌体能够在其表面展示抗体。
随后，将含有目标抗原的库经过一系列的筛选步骤，如淘洗、洗涤和分离，以筛选出与目标抗原特异性结合的抗体。
噬菌体核心蛋白质pIII等表面蛋白链通过基因插入的方法与外源基因连接，实现抗原展示。
二、噬菌体抗体淘筛方法的流程1.抗原制备：首先，需要制备目标抗原。
可以通过多种方法制备抗原，如重组蛋白表达系统、细胞和细胞溶解物、组织和分离物等。
2.抗体库构建：构建包含大量抗体片段的抗体库。
一般使用转录组或基因组DNA作为起始材料，使用PCR扩增抗体基因片段，并将其插入合适的载体中。
3.噬菌体包装：将构建好的抗体库与噬菌体粒子一起包装成噬菌体颗粒。
4.抗原吸附：将噬菌体抗体库与目标抗原进行反应，使抗体与抗原结合。
5.淘洗分离：用洗涤缓冲液对混合物进行混洗，以除去非特异性结合的噬菌体。
6.噬菌体放大：将经过淘洗分离的噬菌体在培养基中进行放大培养。
7.ELISA筛选：使用ELISA检测噬菌体是否与目标抗原的特异结合。
将阴性和阳性对照样品和待测样品加入到蛋白质包被的酶标板孔中，通过检测酶标物质的生成或反应物颜色的变化，判断噬菌体是否与目标抗原结合。
8.质粒DNA提取和测序：选择特异性结合抗原的噬菌体进行质粒DNA 提取和测序，以获取抗体的DNA序列。
9.后续鉴定和分析：鉴定筛选出的抗体的亲和力、特异性、敏感性等性质，以及进行进一步的功能分析。
三、噬菌体抗体淘筛方法的注意事项1.抗原的选择：选择合适的抗原非常关键，抗原应具有特异性且容易从培养基或生物样品中提取。
2.抗体库的构建：构建抗体库时，要确保插入的抗体片段多样性和覆盖性。
3.抗原吸附条件的优化：抗原吸附条件的优化对淘洗分离步骤的效果具有重要影响。
4.筛选条件的优化：在ELISA筛选过程中，需要对反应温度、时间、缓冲液浓度等条件进行优化，以提高筛选效果。
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这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。
由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。
在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。
这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。
这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。
TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。
我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。
使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。
3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。
分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。
用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。
通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。
6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。
（1.5-2小时）7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。
8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。
In advance准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理）在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作Steps ProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of libraries第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体B1和B3 制作文库的第二原种Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selection第二天A7-A12 增殖文库I和J，并且制备噬菌体C1 包被第一轮筛选用免疫管Day 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selection第三天C2-C11 第一轮筛选Day 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selection第四天D1-D6 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selection第五天D7-D11 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第二轮筛选Day 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selection第六天D1-D6 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selection第七天D7-D11 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第三轮筛选Day 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISA第八天D1-D6 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体E1 包被多克隆噬菌体ELISA用的96孔板Day 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISA第九天D7-D11 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）E2-E8 多克隆噬菌体ELISA每个克隆的进一步的描述可以通过单克隆噬菌体ELISA（方案E），单克隆噬菌体ELISA用水溶性的scFv 片段（方案F）。
PCR检测（检测插入，方案H）和测序（方案I）1. 将文库的加入到200ml预热的含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基上2. 37°C振荡培养至OD 600为0.43. 从中取50ml，加入2x1011 KM13辅助噬菌体（剩余的150ml在方案B中用来制备文库的第二细菌储存液）4. 37°C水中温浴30分钟5. 3000g,离心10min,用100ml含有100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml的卡那霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基6. 30度振荡过夜培养7. 将过夜产物在3300g离心30分钟8. 取上层液体80ml，加入20mlPEG/NACL(含20 % PEG，2.5 M NaCl)溶液9. 3300g离心30分钟，倒掉PEG/NACL溶液，重新离心，吸去剩余的PEG/NACL溶液10 用4mlPBS缓冲液悬浮沉淀，11600g离心10分钟，去掉任何剩余的细菌残渣11. 短期使用的话可以保存在4℃，长期保存的话置于含有15%甘油的PBS中，-70℃保存。
12. 将噬菌体稀释100倍，然后继续稀释至6个浓度，加入900μl OD 600 为0.4的TG1至每一个管中，37°C水浴30min,取每个稀释浓度的10μl加入到TYE培养基上，其中包含100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖，37摄氏度过夜培养。
浓度在1012-1013/ml，至少可以进行10次筛选1．将A3步骤中剩余的150ml液体，37摄氏度下振荡培养2小时2、10800g离心10分钟，用10ml含有15%甘油的2xTY悬浮3、每管500微升，分装20管，保存于-70℃。
每次制备的时候用其中一管。
这个仅限于你打算做超过10次筛选的时候。
或者，噬菌体可以用生物素酰化的抗原或者亲和层析来完成1、用目的抗原4ml过夜来包被免疫管。
包被的效率取决于抗原的浓度，温度和缓冲液，通常用抗原浓度10-100 μg/ml的PBS缓冲液。
2. 第二天用PBS缓冲液洗三次（倒入管内，然后马上倒出来）3. 用含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液注满管子，室温下孵化，置于工作台上两个小时候停止4. 用PBS缓冲液洗管3次5. 将1012- 1013噬菌体键入到4ml的含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液。
室温下旋转培养孵育60分钟，然后静止培养60分钟，弃掉上清液6. 用含有0.1%的吐温20的磷酸缓冲液洗管子10-20遍7. 甩干多余的PBS缓冲液，用含有50 μl of 10mg/ml胰蛋白酶的磷酸缓冲液500微升稀释噬菌体，用可翻滚的摇床室温培养10min.8. 取1.5mlOD值为0.4的大肠杆菌TG1，加入250 μl稀释后的噬菌体（剩余的4°C保存），37℃水浴30min..9. 吸取液体，及稀释100倍的，和稀释10000倍的溶液各10微升，加到含有100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上，37度过夜培养来测定噬菌体10、第一轮筛选时如果用复合抗原，取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。
将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。
如果用的是单个的半抗原，糖类或者蛋白质抗原及所有抗原的下面的步骤：取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。
将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。
11. 37°C过夜培养第一轮的筛选是最重要的。
任何的错误都会导致以后的错误。
每轮结束后最少能够得到100个火星的噬菌体，如果少于这个数量，说明可能出现了错误。
所以，试着用新鲜的TG1感染剩余的250ml噬菌体，如果这一步仍然少于100噬菌体，从C1开始重复筛选。
1. 过夜增殖以后，加7ml含有15%甘油的2 xTY到large square Bio-Assay dish或者加2ml到常规的培养皿，然后用玻璃涂布器松散细胞，彻底混匀。
将得到的50 μl细菌接种到50 ml包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的2xTY中。
剩余的1ml保存在15%的甘油中，-70°C保存。
2. 振荡培养至OD600为0.43. 取10ml培养物，加入5x1010辅助噬菌体4 37°C水浴30min5. 3000g离心10分钟。
用含有50 ml包含100 μg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY悬浮6. 30°C振荡培养过夜7. 将过夜产物3300g离心10分钟8. 加入10ml PEG/NaCl (20 % PEG 6000, 2.5 M NaCl)至40ml上清液。