过瘤胃体外模型的测定方法
反刍动物饲料蛋白质瘤胃降解率的评定技术
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降解率 3 ! 4 （515’ 4 *’ 6 7’） 8 9’ 其中： *’ 为通过十二指肠的微生物氮的数 量； 7’ 为通过十二指肠的内源含氮物质的数量； 515’ 为通过十二指肠的非氨态氮的数量； 9’ 为 。 动物的氮进食量 （单位： : 8 ;） 体内法是用真胃瘘管或十二指肠瘘管结合微 生物的天然标记物或其他标记物测定以下三项内 容： 测定十二指肠食糜流通量； 测定通过十二 !） ,） 指肠的内源含氮物质数量； 测定通过十二指肠 <） 的微生物氮的数量。通过测定得到日粮非降解蛋 白质的数量， 计算蛋白质的降解率。体内法测定 结果可靠， 能准确反应蛋白质在瘤胃的降解， 但是 这种方法既花费大量的时间， 又消耗大量的人力、 物力， 对设备要求高， 非常繁琐， 不易推广。 （ !"<.） 应用圆柱状天然丝 ,2, 尼龙袋法 =>?@ 袋研 究 饲 料 在 羊 瘤 胃 中 的 消 化。 ABC%DEF@ 等 （!"#,） 应用尼龙袋法评定甲醛处理饲料对蛋白质 在瘤胃中降解的影响； （!"#"） =GHI%J 和 *+’%@FK; 提出尼龙袋法估测蛋白质消失率的数学模型。近 年来， 尼龙袋法越来越多地用于测定饲料蛋白质 的降解率。我国已制定了尼龙袋法的试行方案。 该法是将待测饲料装入尼龙袋内， 通过瘤胃 瘘管放入瘤胃内培养， 按不同的时间取出尼龙袋， 测定饲料蛋白质在瘤胃内不同停留时间的消失 率， 再结合外流速度计算饲料蛋白质的有效降解 率。该法在活体内进行， 成本低， 简便易行， 能够 较实际的反映出瘤胃内环境条件， 可以进行大量 测定， 并且与体内法有很大的相关性。所以该法 已在世界广泛应用。但是， 许多因素影响尼龙袋 法的测定结果， 如尼龙袋的规格、 样品量、 待测样 品颗粒大小、 培养时间、 冲洗方法及时间、 日粮及 饲养水平、 动物品种及其生理状况等。 ,2< 溶解度法 溶解度法是根据饲料在缓冲液 中的溶解度评定饲料蛋白质降解率的方法。 ;D
胃液及瘤胃内容物检验：瘤胃内容物检验
一、瘤胃内容物的采取采取瘤胃内容物最简便的办法是，当动物反刍时，借食团随食管逆蠕动送至口腔之际，检查人员突然打开口腔，一手抓住舌头向外拉，另一手伸入舌根部，即可将瘤胃内容物收集在手掌中。
然而这种方法仅对健康牛奏效，且每次采取的数量有限。
在临床上，常用胃管吸引法。
经口或鼻插入胃管，到达食管瘤胃口时，感到有一定的抵抗，此时再继续送入50—80cra，按上电动(或手压式)胃液吸引器，即可吸出瘤胃内容物。
也可在左肷部用消毒后的长针头，穿刺吸取瘤胃内容物。
为检验采样的数量，一般吸取100—200m1即够用。
所采胃内容物，用四层纱布过滤后，及时送化验室进行检验。
二、酸碱度的测定1.方法：可用广泛pH试纸测定，也可用酸度计测定。
2.正常值：瘤胃pH一般在6.0—7.0之间。
3.临床意义：pH在4.0—6.0时，为乳酸发酵所致，常见于过食精料引起的瘤胃酸中毒症。
pH在5.0以下时，多数微生物及纤毛虫死亡，发生严重消化障碍。
pH在8.0以上时，可认为由于蛋白质给予过多，引起消化障碍。
在前胃弛缓时，pH值也升高。
三、发酵试验1.方法，取滤过胃液50.0ml，加入葡萄糖4000mg，置于糖发酵管内(该管为一U字形管，右端有一膨大部，左端有m1刻度数)，在37℃恒温箱中放置60min以上，读取产生气体的毫升数。
2.正常值c健康牛羊的糖发酵试验，60min时气体量为1—2m1，甚至可达5—6m1。
3.临床意义：健康牛羊的瘤胃内，由于微生物的作用发酵产气，通过嗳气而排出，所产生的气体，主要为二氧化碳(占65％左右)。
在营养不良，食欲缺乏，前胃弛缓以及某些全身性发热性疾病时，瘤胃内的微生物活动减弱或停止，使糖发酵能力减低，气体的体积常在lml以下。
据测定，黄牛患前胃弛缓时，24h的发酵气体为0.5ml左右。
四、乳酸含量的测定瘤胃液乳酸的测定，应先按前述胃液乳酸的定性检查有无乳酸，需要定量时，可用比色法或气相色谱法定量，现介绍光电比色法如下。
体外模拟技术评定饲料营养价值
主要是采用 胃蛋 白酶和纤维素酶 。酶消化分析测
定 法 利 用 消 化酶 代 替 瘤 胃微 生 物 消 化 ，具 有 Ｔｌｙ ｉｅ ｌ
和 Ｔ ｒ 法 相 同 的缺 陷 与不 足 。相对 于瘤 胃液 方 法 ｅｒ ｙ
微生物的活动和底物 的消化利用 ，其特点是受实验 动物 的限制少 ，反应 条件 易 于控制 ，适 用于 实验 室
不 断分解 产 生氨 氮 ，使 氨氮 浓度 升高 ；同时微 生物 又利用 氨氮 合成 菌体 蛋 白 （ Ｐ ，造成 氨 氮浓 度下 ＭＣ ） 降 ，因此 如果 用 氨氮 来 预测 体 外蛋 白质 的 消化 率 ，
之 间具有 强相 关关 系很 早就被 认识 到 ，产气 技术 被
会导致低估饲料蛋白质 的降解率 。短期人工瘤 胃发 酵 由于没有考虑发酵产物的外流作用 ，会造成发酵 产物 的积累 ，不能真实全面的反映瘤 胃发酵过程 ， 具有一定的局限性 。长期 发酵技术 引入了动态概 念 ，考虑 了产物 的外流 ，似乎更符合瘤 胃内环境 。 用体外培养技术可以用于测定反刍动物饲料 的可利
组织和细胞壁等饲料原料的测定评定。
１２ 酶 解法 ．
酶 解 法是 利 用 商 品酶 （ 胃蛋 白酶 、纤 维 素分 解 酶 、淀粉 分 解 酶 和脂 肪分 解 酶 等 ） 饲料 样 品在 体 与 外 培养 ，来 测定 饲料 养分 的消 化率 的方法 ，酶 解法
人Ｔ瘤 胃技术又称体外培养法和瘤 胃模拟技
价 值 ，两种 方法 的相关 性受 饲料 类型 是否 同一 的影
响 。
１ ． 人 工瘤 胃技 术 ４
后的残渣作为中性洗涤可溶物来估测干物质 的真消 化率 。。尽管此法被广泛运用 ，但也存在一些缺 陷 和不足 ，该 方法 是用 发酵终 点残 留物 作 为测定 结
瘤胃发酵试验方法
瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
奶牛常用精饲料过瘤胃淀粉及其小肠消化率的测定
奶牛常用精饲料过瘤胃淀粉及其小肠消化率的测定近年来国内外对反刍动物过瘤胃淀粉营养进行了大量的研究。
20世纪早期，国外一些研究者认为瘤胃后段消化道对淀粉消化没有明显效果。
与此相反，另一些研究者却认为淀粉在反刍动物小肠中消化比在瘤胃中消化更具有能量优势，能量利用效率比瘤胃降解率高42%，且增加小肠瘤胃淀粉消化对产乳量和乳蛋白量有提高的效果，究其原因可能是由于增加了瘤胃的MCP而引起的。
淀粉在小肠内大约有45％～80%被吸收，可为机体提供更多的葡萄糖,说明适量的过瘤胃淀粉能给反刍动物提供大量的外源葡萄糖,可减少内源合成葡萄糖的能量损失,节约体内的生糖氨基酸，使更多的葡萄糖用于乳的合成,改善乳的组成。
本文采用尼龙袋法和小肠液冻干粉法测定奶牛常用精饲料的过瘤胃淀粉及过瘤胃淀粉在小肠内的消化率以计算这部分过瘤胃淀粉提供的可代谢的葡萄糖量，用以调控小肠可消化淀粉以提高奶牛能量利用率。
1 材料与方法1.1 试验动物和日粮选用2头带有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，日粮设计采用中国奶牛（2001）饲养标准，饲养水平为1.2倍的维持需要，精粗比为55：45，日喂两次，自由饮水。
基础日粮配方见表1。
1.2 试验原料及其处理将6种原料置于60～65 ℃的恒温干燥箱中烘8～12 h，经粉碎机粉碎过1 mm筛。
其营养成分见表2。
1.3 试验方法1.3.1 瘤胃尼龙袋法（参照Tamminga等（1990）推荐的方法）采用分期试验法，共进行6期，依次以尼龙袋法测定6种饲料原料在瘤胃内淀粉的动态降解率并利用Φrskov 和McDonald（1979）提出的饲料营养物质瘤胃降解模型得出了6种原料淀粉降解模型参数和降解率。
依此据Tamminga（1994）提出的公式计算过瘤胃淀粉量。
淀粉的测定采用酶解法参照任莹（2001）的硕士论文。
1.3.2 过瘤胃淀粉小肠内消化率的测定采用奶牛小肠液冻干粉法（FDI）对6种饲料原料的过瘤胃淀粉在小肠内的消化率进行测定。
体外发酵法测定过瘤胃氨基酸瘤胃降解率的研究
体外发酵法测定过瘤胃氨基酸瘤胃降解率的研究
黄永民;冯仰婕;鲍景旦
【期刊名称】《饲料研究》
【年(卷),期】1998()12
【摘要】本研究采用体外发酵法和瘤胃尼龙袋法测定6种自制的氨基酸饲料添加剂的瘤胃降解率，对两种方法所测结果进行了比较，发现体外发酵法测定过瘤胃氨基酸的瘤胃降解率具有简单、稳定，所得结果有较好的准确性和可靠性等优点，适宜用做大规模筛选氨基酸保护材料时的研究方法。
【总页数】2页(P4-5)
【关键词】体外发酵法;过瘤胃氨基酸;瘤胃降解率;奶牛;饲料
【作者】黄永民;冯仰婕;鲍景旦
【作者单位】上海华东理工大学
【正文语种】中文
【中图分类】S823.91;S823.5
【相关文献】
1.瘤胃保护性赖氨酸和蛋氨酸对小尾寒羊瘤胃发酵及粗饲料成分瘤胃降解率的影响[J], 林英庭;王利华;朱风华;李久峰;于静静
2.瘤胃尼龙袋法测定10种饲料过瘤胃淀粉量和淀粉瘤胃降解率 [J], 霍小凯;王加启;卜登攀;王建平;郭同军;李喜艳
3.体外法研究不同水平的可发酵糖与尿素对瘤胃发酵及干物质降解率的影响 [J],
夏楠;王加启;赵国琦
4.可降解蛋白及非蛋白氮对模拟瘤胃体外发酵、营养物质降解率的影响 [J], 马陕红;昝林森;茹彩霞
5.发酵全混合饲料在绵羊体外瘤胃发酵中对纤维降解率、纤维降解菌数量及发酵特性的影响 [J], 王超;薛树媛;李九月;韩红燕
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过瘤胃体外模型的测定方法
过瘤胃体外模型的测定方法一、体外-人工模拟消化液法1，人工唾液配方(MeDougall，1948)-用来模拟动物口腔，测定过瘤胃前的释放率注：MgSO4（MgC12）准确称取一定质量1.0g(精确至0.0001g)样品放入250ml碘量瓶内，每个样做三个重复，加入200ml 人工唾液，溶于少量蒸馏水中定容至1000ml)，盖紧胶塞，在39℃的恒温水浴锅内分别消化0、6和12小时(消化过程中每隔1小时振动1次)，测定溶液中产品的含量，从而求得过瘤胃产品的释放率。
（先将除CaCl2以外的物质充分溶解，再将CaCl2溶解后倒入前者溶液中。
使用前向其中通入二氧化碳，使其pH在8.2左右。
并在39℃的水中温浴30分钟。
）➢McDougall E I. Studies on ruminant saliva, 1. The composition and output of sheep’s saliva.Bilchemical Journal, 1948, 43: 99- 109.2，人工模拟瘤胃液、真胃和十二指肠消化液准确称取一定质量(精确至0.0001g)过瘤胃产品，放入50mL具塞试管底部，加入20mL人工模拟消化液(pH为6.6、5.4和2.4的缓冲溶液，分别模拟动物瘤胃、真胃和十二指肠消化道近端的消化液)，盖紧试管塞，在39℃的恒温水浴摇床内消化0、12、24、48小时，取出后冲洗、过滤，滤液定容，测定滤液中产品的含量。
计算公式:产品瘤胃释放率(W1)=A2/A l x 100%式中:A l-产品中有效成分的含量；A2-产品在pH 6.6缓冲溶液滤液中有效成分的含量。
产品小肠释放率(W2)=A3/A1 x 100%式中:A3-产品在pH 2.4缓冲溶液滤液中有效成分的含量。
产品有效释放率（%）=(l-W1) x W2x100%。
➢Papas A M,Sniffen C J,Muscato T V. Effectiveness of rumen protected methionine for delivering methionine postruminally in dairy cows [J]. J Dairy Sci, 1984a, 67: 545~552.附：人工肠液的制备磷酸氢二钾胰蛋白酶胰脂肪酶胰淀粉酶氢氧化钠6.8g 0.25g 9.375g 83.3mg 调pH注：先将磷酸氢二钾加500ml水溶解，加入胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等，再定容至1000ml，用0.1M氢氧化钠调至适宜pH（6.0-8.0）；二、体外-瘤胃液培养法1，瘤胃液的采集晨饲（6：00）后2小时，由瘤胃内采集足量瘤胃液灌入经预热达到39℃并通有CO2的保温瓶中灌满后，立即盖严瓶口迅速返回实验室，经4层纱布过滤后，持续充入CO2气体5分钟。
利用DAISYII体外模拟培养法测定真消化率
利用DAISY II 体外模拟培养法测定真消化率A. 试剂a) 缓冲溶液A：g/LKH2PO4 10.0MgSO4•7H2O 0.5NaCl 0.5CaCl2•2H2O 0.1尿素(试剂级) 0.5b) 缓冲溶液B：g/LNa2CO3 15.0Na2S•9H2O 1.0c) 瘤胃液接种物。
d) 30 g/L十二烷基硫酸钠（中性洗涤剂）溶液。
称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA,化学纯)和6.81g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)同放入1 000 mL烧杯中,加少量水加热溶解后,再加入30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚。
称取4.65 g无水磷酸氢二钠，置于另一烧杯中， 加少量水，微微加热溶解后倾于第一个烧杯中，稀释至1 000 mL。
此溶液pＨ在6.9~7.0左右（一般不需调整）。
(c) 无水亚硫酸钠（Na2SO3）。
(d) 丙酮：无色，并且蒸发后无残渣。
B.设备a) DAISYII 体外模拟培养箱b) 过滤装置- ANKOM F57滤袋c) 封口机d) 量筒– 1 L & 500 mLe) 热水瓶–2个f) 过滤用奶酪布g) ANKOM 220 纤维素分析仪C. 步骤a) 滤袋和样品准备1)将F57 滤袋在丙酮中浸泡3-5 min，然后放在通风橱中自然干燥。
用丙酮浸泡的目的是除掉表面剂，否则会影响微生物消化。
对每个F57 滤袋称重，记录质量(m1)。
将天平归零，并向滤袋中直接称取0.25 g 样品 (m)注：进行48 h消化研究时，样品量也可以为0.5 g。
然而，最近研究表明样品量为0.25 g 时测定结果更准确。
2) 将每个滤袋封口，并防入Daisy II体外模拟培养箱消化罐中(每个罐中最多可以放25 样品)。
样品应平衡分布在消化罐分隔的两边。
同时至少包括一个空白滤袋，用于确定测定结果校正因子(C1)。
b) 混合缓冲溶液准备(每个消化罐)1) 将缓冲溶液A和B进行预热(39°C)。
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过瘤胃体外模型的测定方法
一、体外-人工模拟消化液法
1，人工唾液配方(MeDougall，1948)-用来模拟动物口腔，测定过瘤胃前的释放率
注：MgSO4（MgC12）
准确称取一定质量1.0g(精确至0.0001g)样品放入250ml碘量瓶内，每个样做三个重复，加入200ml 人工唾液，溶于少量蒸馏水中定容至1000ml)，盖紧胶塞，在39℃的恒温水浴锅内分别消化0、6和12小时(消化过程中每隔1小时振动1次)，测定溶液中产品的含量，从而求得过瘤胃产品的释放率。
（先将除CaCl2以外的物质充分溶解，再将CaCl2溶解后倒入前者溶液中。
使用前向其中通入二氧化碳，使其pH在8.2左右。
并在39℃的水中温浴30分钟。
）
➢McDougall E I. Studies on ruminant saliva, 1. The composition and output of sheep’s saliva.
Bilchemical Journal, 1948, 43: 99- 109.
2，人工模拟瘤胃液、真胃和十二指肠消化液
准确称取一定质量(精确至0.0001g)过瘤胃产品，放入50mL具塞试管底部，加入20mL人工模拟消化液(pH为6.6、5.4和2.4的缓冲溶液，分别模拟动物瘤胃、真胃和十二指肠消化道近端的消化液)，盖紧试管塞，在39℃的恒温水浴摇床内消化0、12、24、48小时，取出后冲洗、过滤，滤液定容，测定滤液中产品的含量。
计算公式:
产品瘤胃释放率(W1)=A2/A l x 100%
式中:A l-产品中有效成分的含量；A2-产品在pH 6.6缓冲溶液滤液中有效成分的含量。
产品小肠释放率(W2)=A3/A1 x 100%
式中:A3-产品在pH 2.4缓冲溶液滤液中有效成分的含量。
产品有效释放率（%）=(l-W1) x W2x100%。
➢Papas A M,Sniffen C J,Muscato T V. Effectiveness of rumen protected methionine for delivering methionine postruminally in dairy cows [J]. J Dairy Sci, 1984a, 67: 545~552.
附：人工肠液的制备
磷酸氢二钾胰蛋白酶胰脂肪酶胰淀粉酶氢氧化钠
6.8g 0.25g 9.375g 83.3mg 调pH
注：先将磷酸氢二钾加500ml水溶解，加入胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等，再定容至1000ml，用0.1M氢氧化钠调至适宜pH（6.0-8.0）；
二、体外-瘤胃液培养法
1，瘤胃液的采集
晨饲（6：00）后2小时，由瘤胃内采集足量瘤胃液灌入经预热达到39℃并通有CO2的保温瓶中灌满后，立即盖严瓶口迅速返回实验室，经4层纱布过滤后，持续充入CO2气体5分钟。
然后，迅速分装至上述已预热好并通有CO2的培养瓶内，每个培养瓶加20ml瘤胃液，盖紧瓶塞放入39℃水浴摇床培养。
2，瘤胃培养底物的制备
培养底物组成：淀粉3g，氯化铵0.1729g，无水硫酸钠0.0269g，以上试剂为分析纯。
3，瘤胃缓冲液的制备
体外批次培养的培养体系为60mL，其中瘤胃液与缓冲液的比例为1：2，培养底物的添加量为0.5g。
采取McDougall缓冲液。
每10LGIF缓冲液含（g）：
98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O。
4，测定方法
称取胆碱样品lg左右，放入已经加入瘤胃液和培养液的培养瓶中(250ml)，摇动混合，向溶液充CO2，使溶液和试管内空间全部充满CO2，然后盖上带有放气阀门的橡皮塞，将其置于水浴摇床培养(39℃)，设置好摇床频率，分别于2、4、8、16、24h，每个样品取出6个瓶子，倾去上清液，剩余物用自来水冲洗三次，至水澄清，除三个样品用于下一阶段的试验，其余三个样品65℃烘干至恒重(48h)，移至干燥器内15min后称重，进行剩余物中胆碱含量，从而测定瘤胃降解率。
三、半体内法-尼龙袋法
1，尼龙袋的制作
选择孔径为35-50μm(250目-400目)的尼龙布，裁剪成15cm x 11cm的长方块，对折，用涤纶线进行双道缝合，制成长x宽为7cm x10cm的尼龙袋。
边缘用烙铁熨烫，使其无散边，密封，用油性笔标号，再用自来水冲洗，浸泡50分钟，然后低温烘干至恒重，备用。
十二指肠尼龙袋：选择孔径为35~50μm尼龙布，裁成7 x 6cm的长方形，对折，然后用尼龙线或涤纶线缝双道，制成6 x 2.5cm尼龙袋。
2，实验方法
选用永久性瘘管反刍动物，分别测定不同包被产品在3，6，9，12，24h时间点的降解率。
每个时间点设3个重复。
预饲期14天，试验期4天，每一试验期结束后转入下一期的预饲期。
3，尼龙袋消化试验及样品的采集制备
将尼龙袋用清水洗净，于65℃烘箱中烘48h，放入干燥器中冷却称重、标号。
于每一尼龙袋中准确称取包被产品，每个样品3个重复，每3个平行袋固定在一条小铁链上，按一次投入、在不同时间点取出的原则将尼龙袋分别进行0，3，6，9，12，24h瘤胃培养。
将尼龙袋从瘤胃中取出，用自来水冲洗，将尼龙袋表面的瘤胃内容物及残渣冲洗，停止微生物活动，直至冲洗干净，冲洗过程不能用手挤压袋内样品，以免增大消失率。
将尼龙袋放入65℃）恒温真空干燥箱内烘干至恒重，然后将烘干恒重的尼龙袋残余物磨碎，-20℃保存待测。
具体操作程序参考rskov等（1980）的方法。
➢Rskov E R, DeB Hovell FD, Mould F .The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs [J].Animal Production, 1980, 5(3):195-213.
四、体外-小肠液冻干粉
1，小肠液冻干粉（GIF）的制备
牛/羊屠宰后立即收集全小肠食糜(十二指肠-回肠末端)，立即放在-50℃冷库中速冻，回到试验室后经冷水解冻，用双层纱布过滤后，于4℃，4000r/min离心约15min，用吸管吸去上层浮油，将上清液倒入表面皿中，置于FTS冻干机冻干，然后将冻干粉迅速分装于可封口塑料袋内，-20℃保存。
2，McDougall缓冲液的配制
每10LGIF缓冲液含（g）：
98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O，用0.2M盐酸调至pH 7.0。
3，胰蛋白酶活性和淀粉酶的检测
胰蛋白酶和淀粉酶的活性测定参照南京建成生物试剂盒说明书的测定方法进行。
4，操作方法
a.过瘤胃产品非降解残渣的制备
称取一定质量1.0 g(精确至0.0001g)过瘤胃胆碱于尼龙袋内，饲喂后1~2h，将尼龙袋投入到装有永久性瘤胃屡管牛/羊的瘤胃内，每只放4个尼龙袋，待饲料在瘤胃内培养16h取出，在-20℃保存备用。
b.测定方法
取出上述样品，解冻，冲洗干净，分别放入50mL三角瓶中，加入提前预热至39℃含o.4gGIF(与试验得出，McDougall缓冲液中GIF的用量为0.4g/30mL)的缓冲液30mL，放入39℃恒温水浴摇床内中速振荡16h，取出冲洗，65℃烘干，然后测定残渣中氯化胆碱的含量。
（16 h 为人工瘤胃体外培养最佳时间也是精料在瘤胃内的滞留时间）
5，计算公式
瘤胃释放率W1(%)=(A1-A2)/A1xl00%
小肠消化率W2(%)=A3xl00%。
过瘤胃有效释放率(%)=(l-W1)xW2x100%。
式：A l一袋中氯化胆碱起始质量；A2一袋中残渣中氯化胆碱.的质量；
A3一产品在小肠冻干粉缓冲液中的氯化胆碱释放率。
五、体内-真胃和小肠释放率-移动尼龙袋法
将1.0g过瘤胃氯化胆碱样品装入十二指肠尼龙袋（6 cm x 2.5 cm）中，放入39℃、pH为2的0.2%的HCl-胃蛋白酶溶液(6 ml盐酸用蒸馏水稀释至1000ml，加热到39℃后加入胃蛋白酶2g，混合均匀)中2.5 h，然后放入十二指肠瘘管内，从粪中回收，冲洗，然后放入40℃烘箱内，烘至恒重，备测。
➢Rossi F, Maurizio M, Francesco M, et al. Rumen degradation and intestinal digestibility of rumen protected amino acids: comparison between in situ and in vitro data [J].Animal Feed Science and
Technology, 2003, 108: 223~229.。