HE石蜡切片
石蜡切片及其HE染色(2014.7.29)
二、HE染色
1、脱蜡：二甲苯I（5分钟）、二甲苯II（5分钟）。【注：烘烤后的切片放至恢复室温后才可脱蜡，一般1~2小时即可。-20℃保存的切片也应恢复至室温后脱蜡，约15~30分钟即可。】
2、复水：100%乙醇（2分钟）、95%乙醇（1分钟）、80%乙醇（1分钟）、75%乙醇（1分钟）、蒸馏水（2分钟）。
5、摊片、烤片：将睾丸石蜡组织块切成5微米厚的薄片。摊片前先铺于30%乙醇溶液中片刻后取出，铺于37℃的水浴锅中，待蜡片将要完全展开前用已挂胶处理的玻片平整捞起。之后应立即放入60~65℃的烤箱中烤片，约1~2小时即可见石蜡成滴变干。烘烤后的玻片恢复至室温后放入-20℃冰箱中保存。【注：应密切控制水中展片时间，避免时间过长造成组织分散。】
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、苏木素染液染色20~30秒，自来水冲洗。
4、分化液分化60~90秒，依苏木素染色深浅而定，自来水冲洗。
5、观察颜色深浅按需返蓝，即浸泡于1%氨水中片刻，时间依颜色深浅而定。
6、伊红染液染色1分钟。自来水冲洗。
7、常规脱水，透明，封片：95%乙醇I（1分钟）、95%乙醇II（1分钟）、100%乙醇I（1分钟）、100%乙醇II（1分钟）、二甲苯I（1分钟）、二甲苯II（1分钟）、中性树胶封固。镜下观察。
2、透明：酒精-二甲苯（1：1）浸泡（15分钟）、二甲苯I（5分钟）、二甲苯II（5分钟）。【注：最后一步时间可作适当调整，待组织变为透明黄色物体时立即取出】
3、浸蜡：A缸（25分钟）、B缸（20分钟）、C缸（25分钟）。【注：A、B和C三缸中石蜡熔点为56~58摄氏度】。
4、包埋：组织用C缸中的石蜡包埋。浇蜡过程中须确保石蜡处于液态，且应一次浇注成型。【注：包埋后的石蜡块置于通风处36~48小时后放于-20摄氏度冰箱中保存。切片时可取出用碎冰装盛。切片过程中若发现蜡块软化，可将蜡块切面冰敷片刻后继续切片。】
石蜡切片HE染色
石蜡切片HE染色1.脱蜡：二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3中各浸泡10分钟。
梯度酒精复水（100％100％，100％，95％，80％，70％）各5分钟。
2.清洗：用PBS洗1次，3分钟。
3.苏木素染色：取苏木素染液用去离子水按1：4稀释，然后染色约5 min（具体时间根据染色的组织而定，一般看到核有较深的蓝紫色就可以了）。
用自来水终止染色。
4.分化：染色后的切片在0.1%盐酸酒精分化3~5 s（具体时间根据染色的情况而定，分化的目的主要是让胞质与核的染色能够区分开，苏木素染色过了的话也可以通过分化后重新染色，这时处理时间需要长一些，如果分化过头即片子着色不深的时候可以再用苏木素染色)。
5.返蓝：分化后的片子置于自来水中，流水返蓝10～30min（具体时间根据染色情况而定，苏木素在碱性溶液中呈蓝色，别人做的时候都是先用弱碱性溶液返蓝后再用自来水冲洗，用时较短，我们是直接用自来水返蓝，由于自来水呈弱碱性，可以达到返蓝效果）。
6.伊红染色：伊红染液用95%酒精按1：1配制成工作液（伊红的贮备液瓶子上有注明），染色30s~1min（时间根据染色情况调整，建议是染深一点好，因为所用的染色伊红为水溶性，弱醇溶性的，在后面的脱水透明的时候非常容易掉色），染色后用去离子水洗1～3s（放在去离子水缸中立即拿去脱水透明）。
7.脱水透明：通风橱里梯度酒精（95％，100％，100％）脱水各30s，二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3透明各3分钟。
（说明：这是我做的时候的步骤，因为按照一般的脱水透明的步骤，最后伊红的着色一般都没有了，原因我前面也说了是由于伊红为水溶性弱醇溶性的，但是按着这样的步骤比较容易污染95%酒精，后来看了相关的资料我的想法是伊红染色后先用95%酒精洗一下，再去通风橱从95%酒精梯度脱水，这样不会污染。
）8.封片：中性树胶封片（一般两滴就够了，从二甲苯中拿出时建议尽量不要让二甲苯干，这样中性树胶能够很快分散开，不会形成气泡）。
HE石蜡切片步骤
HE石蜡切片步骤一、苏木精-伊红对染法——paraffinsection一、器材及试剂：切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，上皮组织盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，一棵胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。
切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖学针，单面刀片，大台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。
中性福尔马林紧固液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。
卡诺（carnoy）紧固液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白黏片剂，中性树胶。
鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的木、茎、叶等。
二、实验原理：石蜡切片就是最基本的切片技术，冰冻切片和轻薄切片等都就是在石蜡切片基础上发展起来的。
苏木素与伊红对比染色法（简称h.e.对染法）是组织切片最常用的染色方法。
这种方法适用范围广为，对组织细胞的各种成分都可以着色，易于全系列面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存有。
经过he染色，细胞核被苏木素涂成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈圆形粉红色。
三、试剂配法：1．中性甲醛紧固液：甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100ml磷酸氢二钠6.5磷酸二氢钾（钠）4g双蒸水900ml2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品3．1%盐酸乙醇液70%酒精100份4．甘油蛋白张贴片剂：蛋白50ml甘油50ml水杨酸钠（防腐剂）1g酿制时将鸡蛋一个超越进碗或杯中，回去蛋黄遗留下蛋白，用玻棒调打为雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。
此时在其中再提等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。
石蜡切片( he)
石蜡制片法（用于免疫组织化学，HE染色）实验原理：HE染色是一种以形态为基础，结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术，用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构。
基本原理：去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
伊红是细胞浆的良好染料。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
《病理检验技术》课件——石蜡切片的HE染色
5～10分钟 5～10分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 1～2分钟 1～2分钟 5～8分钟 2～3秒
石蜡切片的HE染色
11.1%的盐酸乙醇 12.流水冲洗 13.0.5%的伊红水溶液 14.蒸馏水稍洗 15.80%的乙醇 16.95%的乙醇 17.无水乙醇(Ⅰ) 18.无水乙醇(Ⅱ) 19.无水乙醇(Ⅲ) 20.二甲苯(Ⅰ) 21.二甲苯(Ⅱ) 22.中性树胶封片
石蜡切片的HE染色
苏木精
一种天然染料，本身不能染色，氧化后变成苏 木红才成为真正的染料，苏木对细胞核的亲和 力需媒染剂的帮助，此时细胞核呈红色，只有 在碱性环境中，苏木才变成蓝色。
伊红Y
人工合成染料，它可能是通过渗透或弥散作用完 成染色的，故与组织结合不牢固，它对细胞质着 色。
染色原理
石蜡切片的HE染色
2.二甲苯脱蜡后按常规 是用无水乙醇洗去二甲 苯。
4.1%盐酸乙醇分 化液分化时间要 根据分化液的新 旧适当调整。
3.苏木精染液要配好，其好 坏决定染色的优劣。要定期 过滤，避免氧化膜及沉淀等 污染切片。
石蜡切片的HE染色
5.盐酸-乙醇分化后用流水冲洗时间要足够， 目的是把酸彻底冲洗干净，使组织返蓝，也 避免切片残留酸液使切片易褪色。
因此，把第16步的无水乙醇改 为苯酚二甲苯(1:3)混合液进行 脱水，可省去第17步的无水乙 醇，脱水时间3～5分钟，可彻 底脱去切片水分
石蜡切片的HE染色
8.苯酚别名石炭酸，为白色针状结晶，配制苯酚 二甲苯前需要将苯酚放入56℃温箱内或水浴加热 溶解。苯酚如被氧化变成红色，不能使用。
9.使用一些二甲苯代替品如松节油代替二甲苯脱 蜡和透明，可避免二甲苯的毒性，但脱蜡和透明 效果会比二甲苯差，需要增加脱蜡和透明时间。
HE染色(石蜡切片)
（1）脱蜡：染色前，必须将石蜡切片中的石蜡去 除，否则水溶性染料不能与组织结合，这一步称 为脱蜡。脱蜡程序与脱水包埋恰好相反，先将切 片置于二甲苯中使石蜡溶解（5~10分钟），再由 高到低的酒精水化：无水酒精→95%→85%→70% （各级2~5分钟），然后经蒸馏水转入染缸。
组织经固定后含有许多水由于水跟石蜡不能互相溶解因此不能直接进行石蜡包埋还需经过脱水这一过程逐步用某些试剂将组织中的水分置换出常用的脱水剂是酒精脱水的目的是将固定了的组织内的水分去除以便使切片时的支撑物石蜡充分进入组织内水跟石蜡不能相互溶解
HE染色(石蜡切片)
一．取材与组织的固定 二．组织固定后处理及石蜡切片 三．HE染色
1.取材的注意事项 2.组织固定
（1）材料保持新鲜：尽量在动物死后半小时内处理 完毕，投入固定液。
（2）组织块避免挤压：用手术刀切取组织块时切割 时避免来回锉动。取材时，组织块可取稍大一点， 以便在固定后，再将组织块的挤压或损伤部位修 去。
（3）选取好组织块切面：确定是做横切还是纵切。
（4）保持材料清洁：可用生理盐水冲洗组织块，然 后再浸入固定液。
将石蜡包埋块置于切片机切片，厚度5um。 经过修整的石蜡包埋块，在切片之前进行冷冻 （0~-10摄氏度），在夏季高温的情况下冷冻时 间相对要长。在切片过程中，组织面完全暴露， 整张切片必须完整，切片刀要锋利，切片机各 螺丝要旋紧（不切片时切片机要关上保险，防 止被刀片割伤）。
苏木精是一种碱性染料，将嗜碱性的细胞核
20X
40X
（4）脱水与透明：染色后，再进行脱水与透 明，用浓度递增的酒精脱水： 70%→85%→95%→无水酒精（各级2~3分 钟，在95%以下浓度的酒精中伊红易脱色， 应适当缩短时间），之后用二甲苯透明 （10min2次）。
石蜡切片制作和HE染色实验报告
石蜡切片制作和HE染色实验报告自查报告。
实验名称，石蜡切片制作和HE染色实验。
实验日期，2021年10月15日。
实验目的，通过石蜡切片制作和HE染色实验，观察组织结构和细胞形态，掌握组织学技术操作和HE染色方法。
实验步骤：
1. 取得组织标本，进行脱水、透明和浸蜡处理。
2. 将标本置于蜡块中，进行切片制作。
3. 将切片置于载玻片上，进行HE染色处理。
4. 用显微镜观察切片的组织结构和细胞形态。
实验结果，实验中成功制作了石蜡切片，并进行了HE染色处理。
观察切片时，能清晰地看到组织的细胞结构和染色效果良好。
实验分析，通过本次实验，我掌握了石蜡切片制作和HE染色的
基本操作技能，了解了组织学技术的重要性。
同时，观察到了组织
结构和细胞形态的细微变化，对细胞学和组织学有了更深入的了解。
存在问题，在实验中，切片制作过程中需要更加细心，避免切
片出现断裂或者变形的情况。
同时，染色处理的时间和浓度也需要
进一步优化，以获得更好的染色效果。
改进措施，在今后的实验中，我将更加细致地操作每一个步骤，提高操作技能和经验。
同时，我会针对染色处理的时间和浓度进行
实验设计，找到最适合的条件。
结论，本次实验通过石蜡切片制作和HE染色实验，使我对组织
学技术和细胞形态有了更深入的了解，同时也发现了自身在操作技
能和实验设计方面的不足之处。
通过今后的努力和实践，我相信能
够不断提高自己的实验技能和科研水平。
详细论述常规石蜡切片he染色的基本流程
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组织包埋步骤
一、 脱水
① 95%乙醇 Ⅰ 30 min
② 95%乙醇 Ⅱ 30 ~ 40 min
③ 100%乙醇 Ⅰ 20 ~ 30 min
④ 100%乙醇 Ⅱ 20 ~ 30 min
⑤ 100%乙醇 Ⅲ 20 ~ 30 min
⑥ 二甲苯 Ⅰ 20 min
⑦ 二甲苯 Ⅱ 30 min
二、 浸蜡包埋
⑧ 软蜡 30 min
⑨ 软蜡 30 min
⑩ 硬蜡 2 ~ 3 h （或过夜温度低2 ~ 3℃）
⑪ 包埋蜡
切片石蜡58 ~ 60 ℃；脱水、浸蜡过程可在温箱中进行。
常规HE 染色步骤
① 二甲苯 Ⅰ
② 二甲苯 Ⅱ
③ 95%乙醇 Ⅰ
④ 95%乙醇 Ⅱ ⑤ 80%乙醇 （可有可无）
⑥ 蒸馏水 （＜10 min ）
⑦ 苏木精染色 （10 ~ 15 min ）
⑧ 流水稍洗去苏木精液 (1 ~ 3 s 流水冲组织背面)
⑨ 1%盐酸乙醇 （1 ~ 3 s 分化上下移动 去蓝色）
⑩ 流水冲洗 （15 ~ 20 min 去盐酸）
⑪ 蒸馏水过洗 （1min ）
⑫ 0.5%伊红液染色 （1 ~ 3 min ）
⑬ 95%乙醇 Ⅰ
⑭ 95%乙醇 Ⅱ
⑮ 95%乙醇 Ⅲ
⑯ 100%乙醇
⑰ 100%乙醇 ⑱ 二甲苯 Ⅰ （20 min ）
⑲ 二甲苯 Ⅱ （20 min ）
⑳ 二甲苯 Ⅲ （≥20 min ）
21 中性树胶封固 （将周围液体吸去 加光学树胶1滴 盖片）
伊红染液配法
① 水溶性伊红0.5 g ，用最少量水（1 ~ 2 ml ）溶解后
② 用冰醋酸滴加至完全沉淀（呈浆糊状）
③ 加95%酒精至100 ml
苏木素染液配法
④ 苏木素1g
⑤ 100%乙醇10 ml
⑥ 钾明矾 20 g
⑦ 蒸馏水200 ml
⑧ 氧化汞0.5 g ——加热离火后（1 min ）缓慢少量沿杯加入氧化汞，
以免溢出伤人
1%盐酸乙醇（分色）
⑨ 盐酸1ml
⑩ 70%乙醇99ml
淡氨水—在400 ml 自来水中滴2滴
浓氨水—胞核蓝化。