石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片及其HE染色(2014.7.29)
二、HE染色
1、脱蜡：二甲苯I（5分钟）、二甲苯II（5分钟）。【注：烘烤后的切片放至恢复室温后才可脱蜡，一般1~2小时即可。-20℃保存的切片也应恢复至室温后脱蜡，约15~30分钟即可。】
2、复水：100%乙醇（2分钟）、95%乙醇（1分钟）、80%乙醇（1分钟）、75%乙醇（1分钟）、蒸馏水（2分钟）。
5、摊片、烤片：将睾丸石蜡组织块切成5微米厚的薄片。摊片前先铺于30%乙醇溶液中片刻后取出，铺于37℃的水浴锅中，待蜡片将要完全展开前用已挂胶处理的玻片平整捞起。之后应立即放入60~65℃的烤箱中烤片，约1~2小时即可见石蜡成滴变干。烘烤后的玻片恢复至室温后放入-20℃冰箱中保存。【注：应密切控制水中展片时间，避免时间过长造成组织分散。】
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、苏木素染液染色20~30秒，自来水冲洗。
4、分化液分化60~90秒，依苏木素染色深浅而定，自来水冲洗。
5、观察颜色深浅按需返蓝，即浸泡于1%氨水中片刻，时间依颜色深浅而定。
6、伊红染液染色1分钟。自来水冲洗。
7、常规脱水，透明，封片：95%乙醇I（1分钟）、95%乙醇II（1分钟）、100%乙醇I（1分钟）、100%乙醇II（1分钟）、二甲苯I（1分钟）、二甲苯II（1分钟）、中性树胶封固。镜下观察。
2、透明：酒精-二甲苯（1：1）浸泡（15分钟）、二甲苯I（5分钟）、二甲苯II（5分钟）。【注：最后一步时间可作适当调整，待组织变为透明黄色物体时立即取出】
3、浸蜡：A缸（25分钟）、B缸（20分钟）、C缸（25分钟）。【注：A、B和C三缸中石蜡熔点为56~58摄氏度】。
4、包埋：组织用C缸中的石蜡包埋。浇蜡过程中须确保石蜡处于液态，且应一次浇注成型。【注：包埋后的石蜡块置于通风处36~48小时后放于-20摄氏度冰箱中保存。切片时可取出用碎冰装盛。切片过程中若发现蜡块软化，可将蜡块切面冰敷片刻后继续切片。】
石蜡切片HE染色
石蜡切片HE染色1.脱蜡：二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3中各浸泡10分钟。
梯度酒精复水（100％100％，100％，95％，80％，70％）各5分钟。
2.清洗：用PBS洗1次，3分钟。
3.苏木素染色：取苏木素染液用去离子水按1：4稀释，然后染色约5 min（具体时间根据染色的组织而定，一般看到核有较深的蓝紫色就可以了）。
用自来水终止染色。
4.分化：染色后的切片在0.1%盐酸酒精分化3~5 s（具体时间根据染色的情况而定，分化的目的主要是让胞质与核的染色能够区分开，苏木素染色过了的话也可以通过分化后重新染色，这时处理时间需要长一些，如果分化过头即片子着色不深的时候可以再用苏木素染色)。
5.返蓝：分化后的片子置于自来水中，流水返蓝10～30min（具体时间根据染色情况而定，苏木素在碱性溶液中呈蓝色，别人做的时候都是先用弱碱性溶液返蓝后再用自来水冲洗，用时较短，我们是直接用自来水返蓝，由于自来水呈弱碱性，可以达到返蓝效果）。
6.伊红染色：伊红染液用95%酒精按1：1配制成工作液（伊红的贮备液瓶子上有注明），染色30s~1min（时间根据染色情况调整，建议是染深一点好，因为所用的染色伊红为水溶性，弱醇溶性的，在后面的脱水透明的时候非常容易掉色），染色后用去离子水洗1～3s（放在去离子水缸中立即拿去脱水透明）。
7.脱水透明：通风橱里梯度酒精（95％，100％，100％）脱水各30s，二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3透明各3分钟。
（说明：这是我做的时候的步骤，因为按照一般的脱水透明的步骤，最后伊红的着色一般都没有了，原因我前面也说了是由于伊红为水溶性弱醇溶性的，但是按着这样的步骤比较容易污染95%酒精，后来看了相关的资料我的想法是伊红染色后先用95%酒精洗一下，再去通风橱从95%酒精梯度脱水，这样不会污染。
）8.封片：中性树胶封片（一般两滴就够了，从二甲苯中拿出时建议尽量不要让二甲苯干，这样中性树胶能够很快分散开，不会形成气泡）。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤石蜡切片和HE染色方法与步骤1(取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。
注意事项:(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2(固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。
注意事项:(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 脱水50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。
每级0.5h。
注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
(5)如需过夜，应停留在70%酒精中。
(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象4. 透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。
石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤)
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
石蜡切片及染色过程
石蜡切片及染色过程石蜡切片及HE染色过程一、石蜡切片1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm为宜. 取材时间越快越好.2. 固定: 组织取下后应立即放入10%福尔马林(相当于4%甲醛)固定.注意:(1). 固定液量应为组织块体积的40倍.(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等有关. 一般为3—24h.(3)固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.(4)固定容器应大些.3. 漂洗: 流水冲洗2—10h.4. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精.70%(数分钟)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).5. 透明: 组织块脱水后必须经过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂, 而使石蜡进入组织块. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.6. 浸蜡: 组织经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡. 一般需经2—3次浸渍才能完成, 总时间为3—4h. 用于浸蜡的石蜡熔点为52—56℃.7. 包埋: 先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入. 包埋面必须平整. 包埋后石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.8. 切片: 修块→切片→展片→捞片→烤片.二、 HE染色1. 染色前切片处理(1) 脱福尔马林色素.(2) 脱汞盐结晶.(3) 脱黑色素.2. 染色步骤二甲苯脱蜡(10’)→ 无水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自来水洗(2’)→苏木精染色(1—5’)→自来水洗(1’)→1%盐酸酒精分化20s→自来水洗(1’)→稀氨水(1%)反蓝30s→自来水或蒸馏水洗(1’)→伊红染色(20s—5min)→自来水洗(30s)→85%酒精脱水(20s)→90%酒精脱水(30s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性树胶封片.3. 染色结果: 细胞核呈兰色, 胞浆呈红色.三、盐酸酒精的配制浓盐酸0.5—1ml + 75%酒精99ml.此液用一段时间后需延长或更换液体, 新液体分化时间要短.。
组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程
3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。
4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。
苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
12、80%乙醇5min
13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds
14、95%乙醇Ⅰ1min
Ⅱ5min
15、无水乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5min
16、二甲苯+乙醇（1：1）5min
17、二甲苯Ⅰ5min
Ⅱ5min
Ⅲ5min
18、中性树胶封片。
HE染色注意事项：
1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
Ⅱ5min
3、95%乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5mn
4、80%乙醇5min
5、70%乙醇5min
6、D．W．3~5min
7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min）
HE石蜡切片
组织包埋步骤一、 脱水① 95%乙醇 Ⅰ 30 min② 95%乙醇 Ⅱ 30 ~ 40 min③ 100%乙醇 Ⅰ 20 ~ 30 min④ 100%乙醇 Ⅱ 20 ~ 30 min⑤ 100%乙醇 Ⅲ 20 ~ 30 min⑥ 二甲苯 Ⅰ 20 min⑦ 二甲苯 Ⅱ 30 min二、 浸蜡包埋⑧ 软蜡 30 min⑨ 软蜡 30 min⑩ 硬蜡 2 ~ 3 h （或过夜温度低2 ~ 3℃）⑪ 包埋蜡切片石蜡58 ~ 60 ℃；脱水、浸蜡过程可在温箱中进行。
常规HE 染色步骤① 二甲苯 Ⅰ② 二甲苯 Ⅱ③ 95%乙醇 Ⅰ④ 95%乙醇 Ⅱ ⑤ 80%乙醇 （可有可无）⑥ 蒸馏水 （＜10 min ）⑦ 苏木精染色 （10 ~ 15 min ）⑧ 流水稍洗去苏木精液 (1 ~ 3 s 流水冲组织背面)⑨ 1%盐酸乙醇 （1 ~ 3 s 分化上下移动 去蓝色）⑩ 流水冲洗 （15 ~ 20 min 去盐酸）⑪ 蒸馏水过洗 （1min ）⑫ 0.5%伊红液染色 （1 ~ 3 min ）⑬ 95%乙醇 Ⅰ⑭ 95%乙醇 Ⅱ⑮ 95%乙醇 Ⅲ⑯ 100%乙醇⑰ 100%乙醇 ⑱ 二甲苯 Ⅰ （20 min ）⑲ 二甲苯 Ⅱ （20 min ）⑳ 二甲苯 Ⅲ （≥20 min ）21 中性树胶封固 （将周围液体吸去 加光学树胶1滴 盖片）伊红染液配法① 水溶性伊红0.5 g ，用最少量水（1 ~ 2 ml ）溶解后② 用冰醋酸滴加至完全沉淀（呈浆糊状）③ 加95%酒精至100 ml苏木素染液配法④ 苏木素1g⑤ 100%乙醇10 ml⑥ 钾明矾 20 g⑦ 蒸馏水200 ml⑧ 氧化汞0.5 g ——加热离火后（1 min ）缓慢少量沿杯加入氧化汞，以免溢出伤人1%盐酸乙醇（分色）⑨ 盐酸1ml⑩ 70%乙醇99ml淡氨水—在400 ml 自来水中滴2滴浓氨水—胞核蓝化。
组织he染色步骤
设备用具：切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。
试剂：10％福尔马林、酒精、二甲苯、固体石蜡、苏木精、酸水、氨水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶（二）HE染色石蜡切片的制作过程步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
步骤二：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
步骤五：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
步骤六：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
步骤七：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
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石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色
方法与步骤
1(取材
颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。
注意事项:
(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2(固定
将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。
注意事项:
(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 脱水
50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。
每级0.5h。
注意事项:
(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
(5)如需过夜，应停留在70%酒精中。
(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象
4. 透明
1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
注意事项
(1)使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
(2)更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
3)在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱(
水，然后再透明。
5. 浸蜡
将处理的材料置于1/2石蜡+1/2二甲苯中，40?烘箱40min。
再放入石
蜡?30min、石蜡?40min。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。
透蜡时间根据组织大小而定。
透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60?左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。
一般置于恒温箱0.5h。
注意事项
(1)尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度;
(2)透蜡温度要恒定，不可忽高忽低;
(3)操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
6. 包埋
先提升恒温箱的温度至60?，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60?的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签(正面向外置于底部)，补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。
7. 切片
?将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
?将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
?摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
?调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
?调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
?一切调整好后主可以开始切片。
此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。
?切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
?用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
?切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
8. 粘片
将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。
最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30,40?中过夜。
10. 脱蜡和染色
纯二甲苯(10-20min)?纯二甲苯(5-10min)，1/2 二甲苯十1/2纯酒精?100%酒精?95,酒精?85,酒精?70,酒精?50,酒精?自来水冲洗10s?切片放入苏木精中染色约10-30min ?用自来水流水冲洗约15min使切片颜色变蓝。
11. 分化和漂洗
将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。
见切片变红，颜色较浅即可。
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
12. 脱水?和复染
切片入50%乙醇?70%乙醇?80%乙醇中各3-5min。
用0.5%伊红乙醇液对比染色
1-3min。
伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。
反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。
可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
13. 脱水?和透明
将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。
最后用吸水纸吸干多余的乙醇，将切片放入二甲苯?、?中各3-5min。
二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。
切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
14. 封藏
中性树胶封存，因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠
度。