HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4?C 70%乙醇中的组织样品?80%乙醇15 min?95%乙醇15 min?100%乙醇15min ? 2?1/2乙醇1/2二甲苯15 min?二甲苯透明5-10 min?1/2二甲苯1/2石蜡30 min?石蜡（1） 1.5hr?石蜡（2） 1.5-2.5hr?石蜡（3）包埋?RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片?二甲苯(1) 20 min?二甲苯(2) 20 min?100%乙醇20min?95%乙醇10 min?80%乙醇10 min?通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈?切片在PBS中浸泡 5 min*2?0.4%Tritonx RT 10 min?切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4?C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
石蜡切片和免疫组化方法
石蜡切片步骤取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。
固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。
脱水：梯度酒精50% 2h70% 2h80% 2h95% 2h95% 2h100% 40min100% 40min透明：二甲苯Ⅰ 8min二甲苯Ⅱ 5min （观察组织，透明度较好为宜）浸蜡：（蜡温保持在60℃）软蜡Ⅰ 50min软蜡Ⅱ 50min硬蜡Ⅰ 50min硬蜡Ⅱ 50min硬蜡包埋切片：组织化学切片 4μm常规切片 5μm烘片：65℃脱蜡至水：二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅰ 5min梯度酒精至水100% 3min100% 3min95% 3min95% 3min80% 3min70% 3min50% 3min染色：1.常规HE染色苏木素 10min自来水洗 5min盐酸酒精分化 10s自来水洗返蓝 10min伊红 1min自来水洗 5mins蒸馏水 1mins2.免疫组织化学染色1.抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。
time2.消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。
PBS（10mM磷酸钠，150mM 的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min3.封闭：5%BSA封闭30min。
洗涤3*3min4.加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。
TPBS 洗涤3*3min。
1h混合ABC5.ABC试剂孵育30min。
（现配）TPBS洗涤3*3min。
6.加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。
TPBS洗涤3*3min。
7.显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。
TPBS洗涤3*3min。
结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。
苏木精衬染 10min蒸馏水洗涤5min盐酸酒精分化10s（视颜色而定）自来水返蓝4min梯度酒精脱二甲苯水透明封片光镜下染色计数，清洁，封片。
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：（1）APES：现用现配。
将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。
（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
HE染色1.取材切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。
注意事项:(1取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。
2.固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。
注意事项:(1一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。
(2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。
(3固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。
(4材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液镊子触质粒由硬变韧性为准。
(美:固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。
3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。
(20,30,30,60(美:流水冲洗约4小时4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min注意事项:(1脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。
(2在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。
(4在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。
(5如需过夜,应停留在80%酒精中。
(6脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象(美:80%的酒精×2小时95%的酒精×2小时100%的酒精×2小时×2100%的酒精×1小时或者更长时间5.透明(环保透明脱蜡液中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min(至透明为止。
由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项(1使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。
(2更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。
(3在透明过程中,如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。
(美:二甲苯 2小时二甲苯 2小时二甲苯 2小时6.透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液60min,再放入石蜡Ⅰ60分钟、石蜡Ⅱ透蜡30分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等,使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。
透蜡时间根据组织大小而定。
透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。
一般置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项(1尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;(2透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;(3操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
(美:石蜡 2小时石蜡 2小时石蜡 2小时7. 包埋包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。
再将镊子稍加热,夹取材料将切面朝下放入蜡模中,排列整齐。
再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。
8. 切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。
③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4-10微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。
此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min。
⑦切成的蜡带到20-30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。
9. 展片、贴片打开水浴锅,使水温维持在40-45℃,另准备30%乙醇溶液。
②切片时,将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。
(可省③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将切片完整,已展开的切片捞至温水中,使之充分展开。
④另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片1/3处,另一端(磨边,粗糙的一端磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。
10. 脱蜡复水将温箱温度调至65℃,待温度控制在60℃时,将切片连同切片架放入干燥的温箱内3-5小时至蜡熔化。
之后,石蜡切片经脱蜡透明Ⅰ、Ⅱ脱蜡各20min,勿动(防治组织掉此步为关键步,请轻拿轻放。
然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各5min,再放入蒸馏水中3min。
11.染色切片放入苏木精中染色约10-30min。
染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。
室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12.水洗用自来水流水冲洗约15min。
使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可,但要注意流水不能过大,以防切片脱落。
13.分化将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色,约2秒至数十秒钟。
见切片变红,颜色较浅即可。
14.漂洗(反蓝切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15.脱水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。
(没放5016、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。
伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。
反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。
可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。
17.脱水Ⅱ将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3-5min。
最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18.透明切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5min。
二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。
切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。
19.封藏:中性树胶封存因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
封藏的方法:封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。
材料透明后,在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上,迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行,用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。
如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。
如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
免疫组化染色1. 石蜡切片,步骤同前。
切片经贴片后,60℃烤片30min使蜡熔化,经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。
然后,将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min,再放入蒸馏水中3min,水化。
2.脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4,具体看所用抗体及染色试剂说明冲洗3次,每次3分钟。
洗瓶冲洗。
3. 根据抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。
可选步骤,具体见抗体说明书。
4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3次,每次3分钟。
此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。
4. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl的第一抗体,室温下孵育60分钟或4℃过夜,具体参见每种抗体的说明书。
PBS冲洗3次,每次3分钟。
5. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂,室温下孵育10-15分钟。
PBS冲洗3次,每次3分钟。
6. 除去PBS液,每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜下观察3-5分钟(DAB或37℃环境下10-30分钟(AEC。
7. 自来水冲洗,苏木素复染10分钟,PBS或自来水冲洗返蓝。
如果用DAB显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,步骤同H-E染色,中性树胶封固;如果用AEC显色,则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。