源自hPSCs的组织特异性血管内皮细胞回顾

简明回顾：组织特异性微血管内皮细胞源自人类多能干细胞ABSTRACT越来越多的证据提示不同组织类型的内皮细胞（ECs）具有显著的异质性，在组织的产生与动态平衡中起重要作用。

近期的工作揭示出人类多能干细胞（hPSCs）中组织特异性微血管内皮细胞（TS-MVECs）的产生有可能产生组织特异性模型，这可能被应用于再生医学和体外模型应用中。

本文中，我们回顾了到目前为止那些造就hPSC源性TS-MVECs的技术，并讨论现在的hPSC-EC分化流程可能是如何被引向组织特异性命运的。

我们首先讨论活体中EC组织特异性的本质，并回顾了最近十年产生的一般性hPSC-EC分化流程。

最后，我们描述了特异性是如何被整合到hPSC-EC流程中以在体外条件下产生hPSC源性TS-MVECs的，包括EC和实质细胞的共培养，引导性分化，以及引导重编程的策略。

INTRODUCTION内皮细胞（ECs）衬于血管腔，不仅仅是一个被动屏障，而且是有功能的活跃性闸门，对微环境中的变化有动态反应。

ECs位于循环血液成分与周围组织的交界处，在调控生理和病理过程中起关键作用，包括控制微血管通透性，血管生成，凝血，以及炎症。

为了完成如此多样的功能，ECs在各个发育阶段，血管类型（即毛细血管，小动脉，小静脉），以及组织类型间表现出了很高的异质性（1）。

不同组织的微脉管系统在结构和功能水平上都是不同的，这是为了满足该组织的特定需求。

举例来说，大脑中的ECs形成连续的，高度不可通透的屏障，即血脑屏障（BBB），目的是维持微妙的生化平衡以维持正常的脑部功能。

相反，肝脏窦状小管的ECs高度不连续，以促进毒素从血流中清除，而肾小球的ECs有助于滤过血液内容物，以除去有害产物。

离体条件下产生组织特异性微血管内皮细胞（TS-MVECs），用于再生医学和组织建模应用，这有着巨大的利益。

人类多能干细胞（hPSCs），特别是人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（分别是hESCs和iPSCs）由于其可以分化成任何体细胞类型的能力，是产生TS-MVECs 的一种有吸引力的来源。

特别是hPSCs能产生自体同源细胞，并可用于研究离体条件下的人类组织发育机制，这使得它成为一种特别吸引人的TS-MEVCs的来源。

在最近的十年中，使hPSCs向ECs分化的流程不断发展，增进了人们对人类ECs在生理和病理组织状态中所起作用的理解。

近期，一些令人激动的新进展揭示了hPSCs向ECs的分化表现出组织特异性的特点。

本篇回顾的目的就是总结这些进步，并提示出那些可能扩展TS-MVECs应用范围的有希望的方向。

活体中EC组织特异性的特点理想的由干细胞产生的TS-MVECs应当与活体中的同类型细胞尽可能地匹配，匹配的方面有基因和蛋白质的表达，结构，以及功能特点。

活体研究已经识别出了不同组织间毛细血管在组织（回顾见2）和功能（回顾见3）上的主要区别，提示有高度异质性，对这种异质性我们现在已经开始识别其分子基础。

人们观察到在离体条件中缺乏微环境背景的情况下，原代培养的ECs去分化了，高达50%的这类细胞不再表达其组织特异性基因（4），这就产生了对离体条件下TS-MVECs特点进行描述的必要。

ECs的一个主要功能是释放组织特异性血管内分泌因子，支持组织的动态平衡与再生。

举例来说，肝窦状小管ECs（LSECs）通过在时间和空间上控制血管内分泌信号，从而影响肝部分切除后肝脏的再生（5，6）。

在肝切除后的LSECs中，Ang-2一开始是下调的（5），同时Wnt2和HGF是上调的（6），促进肝细胞的生长和增殖，之后Ang-2的表达逐渐恢复以促进血管形成（5）。

在骨组织中，存在毛细血管ECs的亚型，H和L型ECs，它们在血管内分泌的反应上是不同的（7，8）。

H型ECs释放细胞龛信号分子，支持骨祖细胞的生存与增殖（包括Pdgfa和Pdgfb），而L型ECs不分泌（7）。

有趣的是，增加H型ECs细胞的数量增加了骨祖细胞的数量，也增强了骨的形成（7）。

ECs的另一个主要功能是调控离子，小分子，蛋白质，以及细胞的通透性。

举例来说，高度不可通透的脑部ECs组成了血脑屏障，其特点是缺乏小窗，胞饮活动减少，表达极化的外流载体，并且跨内膜电阻很高（TEER）（回顾文章见9）。

实际上，脑部毛细血管的TEER 经测定高达~6000Ω×cm2，取决于受测动物的种类及年龄（10，11），与之相比外周血管的TEER仅有20Ω×cm2（12）。

细胞旁通透性受紧密连接复合物控制，不同组织中这种复合物的表达是异质性的，并且组织也不同（13）。

比如，高度不可通透的脑部ECs表达紧密连接蛋白封闭素（occludin）和claudin-5，而高度通透的LSECs不表达封闭素，仅异质性地表达claudin-5（14）。

基因微阵列已经被证明有助于识别EC组织特异性的决定分子（15，16）。

Daneman等人比较了Tie2-GFP小鼠中脑源性，肺源性，以及肝源性ECs的转录组。

重点关注一组在产生脑部ECs屏障表型上有功能显著性的基因，Daneman等人描述了与肺和肝ECs相比，一些脑EC-特异性的基因，包括紧密连接蛋白（封闭素，Marveld2，以及Jam4），以及来自Slc，Slco，ATP以及ABC载体家族的载体。

血脑屏障富集性基因的路径分析识别出了典型的Wnt和视黄酸X受体信号通路，在脑部脉管系统中上调。

有趣的是，典型的Wnt信号（17~19）和视黄酸信号（20）都涉及发育期间脑部特异性内皮特性的诱导过程。

最近，Nolan等人通过活体内标记和荧光素激活细胞分类（FACS）纯化方法，从小鼠的9个不同组织中游离出了ECs（16）。

他们发现不同组织的ECs在其转录物组上表现出明显的不同，最不相同的ECs（肾和睾丸）在基因表达方面的R2相关系数仅为0.796，而最相似的ECs（心脏和肌肉）其R2相关系数为0.976。

此外，Nolan等人识别出了一组转录因子，血管内分泌因子，以及在不同组织间差异性表达的表面标志物。

举例来说，转录因子SFPI1在肝源性和骨髓源性ECs中富集，血管内分泌因子白细胞介素33在肾源性ECs中富集，表面标志物CD133在脑源性和睾丸源性ECs中富集。

但是，明确的组织特异性内皮标志物还很少。

总的来说，这些分析提示组织特异性应当被定义为各种基因或蛋白质的一种唯一的组合，而不是某个单一因素。

干细胞源性ECs人类干细胞来源对于人类ECs的获取，有数种不同的干细胞来源，同时包括多能干细胞和成体干细胞。

成体干细胞群包括骨髓单核细胞（21），外周血单核细胞（22~26），脂肪源性干细胞（27），以及心脏祖细胞（28），已经显示出具有分化成ECs的能力。

但是，成体干细胞的限制包括分化的能力，常由异质性细胞群组成（29），以及在某些例子中随着老化而丧失增殖与分化能力（30）。

源自胚球内细胞团的hESCs（31），以及后来从已经终末分化的体细胞中产生的hiPSCs（32），克服了成体干细胞的某些限制。

人们对代表了某种患者特异性表型的hPSC源性ECs的利用能力使hPSCs成为一种十分强力的工具，可以用来进一步理解生理状态和病理状态下的ECs，并可能在细胞再生方面起重要作用。

干细胞源性ECs的特点描述没有单一的ECs标记物；而是一群标记物的联合，可用于ECs的识别。

最有确定性的结构性表达的内皮标记物包括PECAM（CD31），血管内皮（VE）-钙黏着蛋白（CD144），内皮一氧化氮合成酶（eNOS），von Willebrand因子（vWF），血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2），以及Tie-2（34）。

一些功能测定可以用于描述hPSC源性ECs的表型。

ECs释放的一氧化氮在活体血流与血压的控制方面起关键作用（35），并可在离体条件下测定（36）。

摄入乙酰化的低密度脂蛋白，是健康ECs的另一个特点（37）。

ECs受炎性细胞因子比如TNF-α激活，诱导粘附分子比如ICAM-1的上调，它捕获循环血液中的白细胞，可能在内皮祖细胞样细胞向受损脉管的旁分泌过程中起重要作用（38）。

离体条件下血管生成测定及脉管生成测定需要EC的增殖与迁移（39，40），测定办法是将经VEGF处理过的ECs放在除去生长因子的基质胶上，然后观察含有管腔的管样网络。

这样的测定也可在活体条件下进行，方法是将细胞悬浮在含有基础性成纤维生长因子（bFGF）的基质胶混合物中，然后皮下注射到免疫缺陷的动物中。

之后可以去掉附加的基质胶，通过内皮和物种特异性标记物的表达来识别出毛细血管。

从hPSCs中产生ECshPSCs向ECs的分化，在最近的十年里取得了很大的进展，表1列举了其中一些进步。

首先，原代细胞共培养被用于引导hPSCs转向EC命运。

在有小鼠骨髓基质细胞系OP9的情况下，hPSCs和hiPSCs都可以诱导分化成ECs（41，42）。

OP9细胞的强烈造血促进活性可能是由Notch配体表达，蛋白表达，以及一些未被识别的旁分泌因子表达方面的不同所产生的，而这种活性可能使得hESC向ECs分化。

这些研究的作者假设这些分泌的因子可能引导hPSCs向内皮细胞状态分化，提出有可能是旁分泌信号途径调控了hPSCs产生组织特异性的ECs。

一种附加的方法常用于获得hPSCs源性的ECs，它利用胚状体（EB）形成。

一些EB流程使用生长因子，首次诱导出了CD31+CD34+祖细胞群，这种细胞群一旦游离出来并暴露在合适的环境条件下，就可以产生ECs。

Levenberg等人揭示了将hESC源性EBs培养10天后，2%的细胞表达CD31（45）。

将生长因子IGF和EGF与VEGF和FGF2一起加入，产生约12%的CD31+细胞（43）。

Rufaihah等人在有骨形态生成蛋白4（BMP4）和VEGF存在的情况下从hiPSCs 形成了EBs（39）。

EB形成，细胞在缺乏BMP4的条件下扩张10天，之后有约15%的细胞群表达CD31。

在近期由James等人做的一项研究中，hESCs在依次暴露于BMP4，ActivinA，以及FGF2后，加速形成EBs。

在第4~7天，EBs在基质胶上铺开，并用VEGF-A处理。

这些条件产生了相对较松散的ECs细胞群，其标志物是VE-钙黏着蛋白-GFP（~0.2%）。

但是，第7天时TGFβ的抑制使内皮分化效率增加了10倍。

之后，经过磁性激活细胞分类（MACS）纯化的CD31+细胞，用TGFβ抑制，使其扩张增加了36倍（47）。

这些研究提示在一开始向EC 祖细胞分化后，操纵某些特殊的信号通路增加了细胞的增殖，并保存EC表型，approaches which could prove vital in the derivation of tissue-specific ECs。