组织学绪论

免疫细胞化学的方法
免疫细胞化学技术主要有直接法和间接法（图1-5）。直接法是 标记某抗原的特异性抗体（又称第一抗体），用标记的第一抗 体孵育标本以检测其中的抗原成分。在间接法中，第一抗体不 标记；以第一抗体作为抗原免疫另一动物，制备抗第一抗体的 抗体，即第二抗体，并标记第二抗体。染色时，先后以第一抗 体和标记的第二抗体处理标本，在抗原存在部位形成抗原-第一 抗体-标记第二抗体复合物，以达到检测该抗原的目的（图1-6）。
（九）形态学研究的定量术
1．形态计量术
形态计量术（Morphometry） 是运用数学和统计学原理 对组织和细胞进行二维和三维形态学测量的一种研究技术， 如细胞及其微细结构的数量、表面积、体积、周长等的相 对值和绝对值。其中三维立体结构的研究又称体视学。传 统的体视学方法是将测试系统（点、线、网格等）投影或 覆盖在切片或照片上，进行测点计数、交点计数、轮廓计 数、粒子计数或长度测量等测试，根据平面测量的数据按 一定的数学公式推算出其立体数值。
3．活体染色与活细胞染色
活体染色与活细胞染色（Vital Staining and Vital Cell Staining） 活体染色是将无毒的染料注入动物体内，组织或细胞选择 性摄取染料后，通过显微镜观察，研究其分布和功能等。 如将墨汁注入动物体内，被巨噬细胞吞噬，从而观察巨噬 细胞的分布和吞噬活性。也可对分离的活细胞或体外培养 的细胞直接进行染色，称体外活体染色。如取血液，与煌 焦油蓝染液混合，染色数分钟后涂片镜检，可显示网织红 细胞并进行计数，以判断骨髓的造血功能。
显微镜下的药物胶囊
图1-1 光学 显微镜模式图
示光镜的主要构 成成分和光路
图1-2 石蜡包埋标本切片机
图1-3 激光共聚焦扫描显微镜成像原理示意图
图1-4 PAS反应示肝细胞内的糖原颗粒（箭头） 苏木精复染 高倍
图1-5 免疫细胞化学基本原理示意图
图1-6 免疫细胞化学ABC法染色示大鼠腺垂体 黄体生成素阳性细胞 高倍
糖类物质常用过碘酸-Schiff反应(PAS反应)显示（图1-4）。 脂类常用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等脂溶性染料染色。
（五）免疫组织化学
免疫组织化学是根据免疫学原理，应用带有可见标记的特 异性抗原-抗体反应，检测组织、细胞中多肽和蛋白质等 大分子物质的一种技术。进行免疫组织化学染色时，首先 要获得被检多肽或蛋白质等大分子物质的抗体。其次，要 对抗体进行标记。常用的标记物有荧光染料，如异硫氰酸 荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texas red)；酶类，如辣根过氧 化物酶、碱性磷酸酶等；重金属，如胶体金、铁蛋白等。 最后，应用标记抗体孵育标本，标记抗体即与组织细胞中 的相应抗原发生特异性结合，可分别在荧光显微镜、普通 光镜和电镜下观察。
第1章 组织学绪论
Introduction of Histology
一、组织学的研究内容和意义
组织学（histology）是研究机体微细结构及其相关功能的 科学。只有学好组织学，认识人体的微细结构及其相关功 能，才能全面掌握人体的形态结构，探索生命现象的物质 基础。也只有认识了人体的正常结构，才能更好地分析和 理解人体的生理过程和病理过程，才能学好生理学、病理 学及其他医学基础课程和临床课程。
透射电镜术（Transmission electron microscopy） 用电子束 穿透标本，经过电磁透镜的会聚、放大后，在荧光屏上成 像，直接观察，或将影像投射到照相底片，制成电镜照片 进行观察。透射电镜的分辨率可达0.1～0.2 nm，放大倍数 从几千倍到几十万倍。由于电子束穿透力弱，电镜标本需 制成50～80 nm的超薄切片。
图1-8 电镜免疫细胞化学染色 （胶体金标记第二抗体法）
箭头示狒狒下丘脑酪氨酸羟化酶阳性轴突内的胶体金颗粒
图1-9 原位杂交光 镜像 高倍
A．35S标记前列腺特 异 抗 原 （ PSA ） cDNA 探针，放射自显影显 示人前列腺上皮内PSA mRNA 的 表 达 ， 苏 木 精复染
B．地高辛精标记蛋白 激酶C（PKC）β1寡核 苷酸探针，免疫细胞 化学显示大鼠海马锥 体 细 胞 内 PKCβ1 mRNA的表达
（三）电子显微镜术
电镜（Electron Microscopy）不同于光镜之处是用电子束代 替可见光，用电磁场代替玻璃透镜。电镜又分为透射电镜 术和扫描电镜术。
各种显微镜的分辨率与人眼的比较
人眼 普通光镜 透射电镜 扫描电镜
分辨率 0.2 mm 0.2 µm 0.1~0.2 nm 2.5 nm
l．透射电镜术
为了在一张组织切片上同时显示两种抗原物质，以发现其定位、 形态、甚至功能上的相互关系，可使用免疫细胞化学双重染色 （double staining）（图1-7）。
电镜免疫细胞化学常用胶体金标记技术（图1-8）。
（六）原位杂交
原位杂交是一种在组织细胞原位进行的核酸分子杂交技术， 敏感度高，特异性强，是当前分子生物学研究的重要手段。 原位杂交的原理是两条单核苷酸链通过碱基互补原则紧密 结合，形成稳定的杂交体。根据这一原理，用一条碱基序 列已知、经特定标记的核苷酸链为探针，与组织切片、细 胞制备或染色体标本中的待检DNA或mRNA片段进行杂交， 然后显示标记物，从而获得待检核酸的分布和含量等信息 (图1-9) 。按照探针分子的性质，可将其分为cDNA探针、 cRNA探针和寡核苷酸探针。
2．扫描电镜术
扫描电镜术（Scanning electron microscopy） 用于观察细胞、 组织和器官表面的立体微细结构。将小块组织（直径约0.3 cm）经固定和临界点脱水干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜 和金属膜。扫描电镜发射的细电子束在样品表面按顺序逐 点移动扫描，使样品表面金属膜发射出电子（称二次电 子），二次电子信号被探测器收集，经过放大，在荧光屏 上成像。扫描电镜的景深长，图像清晰，富有立体感。
4. 活细胞与死细胞的鉴别
有些染料不能进入活细胞，但可进入细胞膜通透性发生改 变的死细胞。如活细胞对台盼蓝拒染，而死细胞被染成蓝 色，常用此方法检测培养细胞的存活率。Hoechst 33258和 碘化丙啶是常用的荧光染料，均可与DNA结合。Hoechst 33258可进入活细胞和凋亡细胞，使细胞核呈蓝色荧光， 活细胞的荧光均匀，凋亡细胞的荧光不均匀、增强或边聚。 碘化丙啶只能进入死细胞，使其核呈红色荧光。因此，用 这两种染料进行体外活体染色，可区别活细胞、凋亡细胞 和坏死细胞（图1-12）。
二、组织学发展简史
1．显微镜的发明和细胞的发现； 2．显微镜的改进和细胞学说的确立； 3．组织概念的提出和组织学的建立诺贝尔奖； 4．现代组织学的发展。
HE染色
组织学中最常用的染色方法是苏木精（hematoxylin）和伊 红（eosin）染色法，简称HE染色法（HE staining）。苏木 精使细胞核和细胞质中的核糖体等酸性物质染成紫蓝色， 伊红使细胞质和细胞外基质中的碱性成分染成淡红色。与 碱性染料亲和力强、易被染色的特性称嗜碱性 （basophilia）；与酸性染料亲和力强、易被染色的特性称 嗜酸性（acidophilia）；若与两种染料的亲和力都不强，则 称中性（ow Cytometry） 是近年建立的细胞定量 和分类技术，可对细胞进行生物化学和生物物理特性的快 速定量测定。流式细胞仪由液流系统、激发光器件、信号 检测系统和控制系统、细胞分选系统等组成。其工作原理 是分离被检细胞，制成单细胞悬液，并进行荧光染色或标 记，然后使单细胞液流快速通过该仪器的激光照射分析区， 被检细胞产生不同的荧光信号转变为电脉冲，分别输入计 算机内贮存，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群 体中不同类型细胞的有关数据。流式细胞术广泛应用于细 胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学等的研究。
图1-7 荧光免疫细胞化学双重染色 高倍
大鼠中脑含酪氨酸 羟化酶（TH）的神 经元被FITC标记， 胞质呈绿色（粗箭 头）；含钙结合蛋 白 D28K （ CB ） 的 神经元被得克萨斯 红标记，胞质和胞 核呈红色（细箭 头 ） ； TH 和 CB 都 含的神经元胞质呈 黄色，胞核呈红色 （双箭头）
2. 组织工程
组织工程是用细胞培养术在体外模拟构建组织或器官的技 术，它是生物医学和材料科学交叉融合的产物，也是目前 生物医学研究的热点。国内、外学者应用组织工程技术已 开展了许多人造组织和器官的研制，如皮肤、软骨、骨、 肌腱、角膜、神经、血管、气管等，其中组织工程化皮肤 和软骨已获得成功，并用于临床（图1-11）。组织工程的 基本方法是：取少量组织，分离、培养细胞（称种子细 胞）；应用人工合成的有机高分子聚合物（如聚羟基乙酸 和聚乳酸）或天然的细胞外基质成分（如胶原和纤维蛋白） 制备有一定形状和空间结构的三维支架；将种子细胞种植 到支架上，在体外培养或植入体内；细胞生长增殖，并分 泌细胞外基质，而支架材料逐渐降解吸收，从而形成有一 定结构和功能的组织或器官，用于组织修复。
（二）激光共聚焦扫描显微镜
激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope， CLSM)是一种高光敏度与高分辨率的生物学仪器，主要由 激光光源、共聚焦成像扫描系统、光学系统和计算机图像 分析系统4部分组成。CLSM光源产生激光束，并通过入射 针孔的光阑作用入射到样品各点上。另外，在发射光检测 光路上有一个检测针孔，检测针孔和入射针孔的位置相对 于物镜的焦平面是共轭的，即所谓“共聚焦”。经样品反 射的光通过透镜成像，被探测器接收，再经过光电信号转 换在显示屏上；图像同时被传送到计算机图像分析系统， 进行二维或三维的分析处理（图1-3）。
（十）示踪术
示踪术是用细胞标记技术追踪细胞运动轨迹、细胞分化途 径和细胞来源的一种研究方法，是胚胎学研究中的常用技 术方法，如对神经嵴细胞的迁移和分化研究。常用尼罗蓝、 中性红、辣根过氧化物酶、放射性同位素等作为示踪标记 物。这些示踪剂应用方便、标记明确、易于观察，但会随 细胞的分裂增殖而逐渐衰减和消失，因而不能长期追踪。 近年来，人们将含有某一报告基因的逆转录病毒导入某种 细胞，该基因的表达产物变成了这种细胞的示踪标记。这 种自然标记和转基因标记不会随细胞增殖而衰减，可长期 示踪。