里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造
绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定
绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定王翠艳;王玉华;朴春红;刘俊梅;胡耀辉;任大勇;于寒松【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2016(037)019【摘要】采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。
参照GenBank上发表的绿色木霉（Trichoderma viride）cbhⅡ基因（GenBank登录号：M55080）设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其cDNA序列长1441 bp。
为了达到表达分泌该酶的目的，在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。
进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化，通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ基因。
将该基因与穿梭表达载体pMG36e连接,构建原核表达载体pMG36e-S-cbhⅡ；利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌，纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到一条约为53 kD的目的蛋白条带，与预期大小相符；利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/mL，菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。
结果表明，纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别，并成功实现了胞外表达。
【总页数】6页(P141-146)【作者】王翠艳;王玉华;朴春红;刘俊梅;胡耀辉;任大勇;于寒松【作者单位】吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118; 国家大豆产业技术研发中心加工研究室，吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118;吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118【正文语种】中文【中图分类】Q7【相关文献】1.绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达 [J], 付永平;宋冰;王丕武;卢实2.哈茨木霉HP37-4纤维二糖水解酶Ⅰ基因的克隆及表达 [J], 吴柳;张政;卢业飞;秦秀林;刘君梁;冯家勋3.里氏木霉纤维二糖水解酶II基因的高表达 [J], 方浩;夏黎明4.黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表达 [J], 王冰冰;夏黎明;杜风光5.哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶Ⅰ基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达 [J], 卢业飞;吴柳;秦秀林;冯家勋;刘君梁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纤维二糖水解酶I基因的系统进化分析
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第 １ １ 卷 第 ４期
２ ０ １ ３ 年 １ ２月
生 物 信 息 学
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里氏木霉
里氏木霉一、里氏木霉概述：里氏木霉是多细胞的真核微生物，红褐肉座菌的无性型,隶属于丛梗孢目木霉属。
其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。
里氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶，由单拷贝基因编码，其产量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%。
由此可见，纤维二糖水解酶启动子是很强的启动子。
因此在对里氏木霉的遗传改造中，常利用纤维二糖水解酶的启动子与终止子序列构建载体，并利的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。
里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化等。
由于里氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对里氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。
里氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。
近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的里氏木霉重组菌株是安全无害的。
二、里氏木霉使用说明：里氏木霉主产纤维素酶-纤维二糖水解酶，具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，一般采用的发酵方法有两种：固态发发酵和液体深层培养发酵生产纤维素酶，产生的纤维素酶是胞外酶。
现在的固体发酵比较的成熟，液态发酵一般采用的是流加发酵。
主要用于秸秆腐熟剂添加使用。
用途：作为饲料添加剂使用,作饲料用：1.提高饲料原料中营养物质的转化，提高原料的消化能力和代谢能力，提高动物生产性能。
2.提高内源酶的分泌及活性，促进营养物质的消化吸收，提高饲料利用率。
3.促进动物肠道内有益菌的生长从而抑制有害菌的繁殖，有效提高了动物的免疫力，并有效防止腹泻。
使用量：建议添加80-100克/吨。
添加方法：均匀的混合于粉料中保存方法:25℃以下低温干燥保存注意事项:防暴晒、雨淋，避免高温或阳光直射；防止与皮肤或粘膜性物质接触。
纤维素酶的研究进展与发展趋势
纤维素酶的研究进展与发展趋势摘要介绍了国内外纤维素酶的研究进展,并简要阐述了纤维素酶研究的发展趋势。
关键词纤维素酶研究进展趋势纤维素是植物细胞壁的主要成分,广泛存在于自然界,是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。
随着世界人口的增长,为解决日益加剧的食品和能源危机,纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。
纤维素酶能够有效地分解天然纤维素,是解决能源危机,食品和饲料紧张及环境污染等问题的重要途径之一。
1 纤维素酶的研究在自然界中,绝大多数的纤维素是由微生物通过分泌纤维素酶来进行降解的。
早在l850年,Mifscherlich己经观察到微生物分解纤维素现象。
但纤维素酶的研究则是从1906年Seilliere在蜗牛消化液中发现了分解天然纤维素的酶,以后才逐渐开始的。
1912年Pringsheim从耐热性纤维素细菌中分离出纤维素酶。
1933年Grassman分辨出了一种真菌纤维素酶的两个组分。
1954年,美国陆军Natick 实验室开始研究军用纤维素材料微生物降解的防护问题,后来发现纤维素经微生物降解后,可产生经济、丰富的生产原料,并且有望解决自然界不断产生的固体废物问题,于是纤维素酶得到了广泛的关注。
50年代,纤维素酶工作转向纤维素酶本身的性质、作用方式、培养条件、测定方法等研究。
l958年,美国华盛顿大学Fry等人用酶水解非淀粉多糖,从那时起,纤维素酶的研究在世界许多国家迅速推广,特别在产纤维素酶的微生物选育、培养条件、纤维素酶的性质、纤维素酶的分离、提纯和协同作用方面的研究进展较快。
60~70年代,Nisizawahe Woo等人对绿色木霉和黑曲霉的纤维素酶做了大量的研究,将纤维素酶分成不同组分,并进行了鉴定。
70~80年代开始利用诱变等育种手段对产纤维素酶的微生物进行了改造,提高其产酶活性。
80年代以后,人们开始利用遗传工程从分子生物学水平对纤维素酶生产菌株进行诱变育种,并对纤维素酶蛋白质的氨基酸序列及其分离纯化等方面进行了深入细致的研究。
改造瑞氏木霉cbh1启动子提高外源基因表达
Development of Trichoderma reesei cbh1 promoter to improveheterologous gene expressionLiu Ti，Wang Tianhong *，Li Xian，Liu XuanState Key Laboratory of Microbial Technology，Shandong University，Jinan（250100）E-mail：wangtianhong@AbstractTo improve heterologous gene expression in Trichoderma reesei, a set of optimal artificial cbh1 promoters were obtained. The -677～-724 region with three potential glucose repressor binding sites was deleted. And then the -620～-820 region of the modified cbh1 promoter including the CCAAT box and Ace2 binding site was repeatedly inserted into the modified cbh1 promoter, obtaining promoters with copy number 2, 4 and 6, respectively. The experimental results showed that the glucose repression effects were abolished and the glucuronidase (GUS) reporter gene expression guided by these multi-copy promoters was markedly enhanced as copy number increased simultaneously. The date showed the great promise of utilizing promoter artificial modification strategy to increase heterologous gene expression in filamentous fungi and provided a set of optional high-expression vectors for gene function investigation and strain modification.Keywords：Trichoderma reesei；cbh1 promoter；carbon catabolite derepression；targeted deletion；multiple-copy strategy1. IntroductionFilamentous fungus Trichoderma reesei is one of the most efficient cellulase producers and has a long history in producing hydrolytic enzymes. Several mutant strains can produce cellulases of 40 g l-1 and the major cellulase, CBH I, accounts for about 50% of all secreted proteins [1]. Thus, cbh1 promoter has been considered the strongest promoter in T. reesei, which is generally used to construct high-efficient expression vectors to yield homologous and heterologous proteins [2-3]. Compared with the high production of homologous proteins in T. reesei, the yield of the heterologous proteins is rather low. Thus how to improve the expression of heterologous proteins becomes a significant issue of fungal molecular biology. Furthermore, T. reesei genome has been sequenced recently [4]. The function of a large quantity of genes in the sequenced genome is unknown and needed to be elucidated. Therefore, the construction of the high-expression vectors has become an increasingly important requirement for the study of molecular genetics, as well as for the strain improving.In fungi, the production of cellulolytic enzymes is finely mediated at the level of transcription. Usually, both the pathway-specific regulation such as induction and repression and the wide-domain regulation controls are operating at the transcription including the transcriptional regulation by the available carbon source, the CREI/CreA carbon catabolite repressors from T. reesei and aspergilli, the activators ACEII from T. reesei and a CCAAT box-binding protein in filamentous fungi [5].In T. reesei, cellulase genes are repressed in the existence of glucose by the wide-domain carbon catabolite repressor CREI as well as CREA of the Aspergilli. Cellulase genes are induced in the existence of cellulose or its derivatives. In T. reesei, three putative CREI binding sites presenting in -674~-724 of the cbh1 promoter are considered to be involved in glucose repression depended on the binding affinities of the CREI protein in the glucose medium[6-7]. ACEII binds to the 5'-GGCTAATAA-3' sequence in the cbh1 promoter (around –783), which leads to positive regulation of primary cellulase genes (cbh1, cbh2, egl1 and egl2) and xyn2 in cellulose-induced cultures [8].The CCAAT sequence is one of the most ubiquitous elements presenting in 30% of eukaryotic promoters. The CCAAT sequence exists around -700 of the cbh1 promoter in T. reesei and is recognized by the Hap protein complex. The complex comprises three subunites,Hap2,Hap3 and Hap5,which enhances the overall strength of the promoter activity and increases the expression level of many genes, such as acetamidase-, amylase-, cellulase- and xylanase-encoding genes[9-10]. It is regarded as anessential and functional element for high-level expression of genes in filamentous fungi [11] and higher eukaryotes. In addition, the activity of the cbh2 promoter in T. reesei has been shown to be dependent on the Hap protein complex binding to the CCAAT box [10].The Escherichia coli beta-glucuronidase (UidA or GUS) gene has been used as a successful reporter marker gene in several transgenic organisms such as plants (12-13), the yeasts (14-15) and Yarrowia lipolytica (16) and bacteria and in filamentous fungi (17), due to the unparalleled sensitivity of the encoded enzyme and the ease with which it can be quantified in cell-free extracts and visualized histochemically in cells and tissues and the stabilization and activity in a wide pH range.In this study, utilizing strategy of promoter artificial modification, a breeding strategy was designed to improve heterologous gene expression in filamentous fungi. A set of optimal and effective vectors can evidently improve the expression level of heterologous proteins in Trichoderma and other filamentous fungi, as well as provide a useful and efficient tool for academic researches and industrial applications.2. Materials and methods2.1 Strains, plasmids and culture conditionsThe protease-deficient strain T. reesei RutC-30 U4 [18] which is cre1 mutant was used to be the recipient strain. Growth conditions, media and genomic DNA isolation method of T. reesei were performed as the method of Penttilä et al [19]. The growth medium contains glucose、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O 、ZnSO4·7H2O、CoCl2 (pH5.5). For the extraction of RNA and the detection of enzyme activity, T. reesei was grown in lactose medium.2.2 DNA and RNA manipulationTotal RNA was isolated according to the method of Verwoerd et al [20]. DNA and RNA manipulations were carried out using standard procedures [21].2.3 Construction of expression vectorsThe Pst I-Eco RI fragment containing the cbh1 terminator of T. reesei and multiple restriction sites of vector pTRIL [22] was inserted into pUC19 digested with the same enzymes[23] and created vector pT. The GUS gene was amplified from vector pNOM102 [24]using primers A and B (Table 1). The amplified fragment was digested with Xho I and Xba I, cloned into pT and generated vector pTG.The -16~-1301 and -16~-868 regions of cbh1 promoter were obtained by PCR, using primers C, D and primers E, D (Table 1) respectively. The two PCR products were digested with Pst I and Kpn I, and inserted into pTG respectively to construct expression vectors pL and pC.The -677~-724 region of the cbh1 promoter was deleted by overlap PCR, using primer pairs E, F and G, D (Table 1) to amplify corresponding sequences in the promoter, then the target sequence was obtained with primers E and D (Table 1). The amplified fragment was digested with Pst I-Kpn I and inserted into pTG, creating vector ∆pC.A 200-bp DNA fragment (-620~-820 region) containing CCAAT box and Ace2 binding sites located in the cbh1 promoter of ∆pC was amplified by PCR using primer pairs E and H (Table 1). After treatment with T4 DNA polymerase and digestion with Pst I, the DNA fragment was inserted back between Pst I and Stu I sites of ∆pC, creating plasmid ∆p2C. Similarly, vectors ∆p4C and ∆p6C carrying 4 and 6 copies of the 200-bp fragment were obtained respectively with primers M13-R and I (Table 1) using ∆p2C as the template.2.4 Transformation of T. reesei and isolation of the positive transformantsThe GUS expression vectors with different modified promoters were co-transformed into the recipient T. reesei RutC-30 U4 [18]with plasmid pAN7-1 vector carrying a hygromycin resistance cassette [25]. The hygromycin-resistant transformants were selected on minimal medium containing 100µg/mlhygromycin B and sorbitol. Then, the potential GUS-positive transformants were analyzed by PCR amplification with primers J and K (Table 1) and primers L and M. The two amplified fragments were sequenced, using the dideoxy sequencing technique. At the same time, the potential GUS-positive transformants were further analyzed by PCR amplification using primers 5' –CTATACGCCATTTGAAGCC - 3' and M13/pUC Reverse Primer to confirm the modifications made of promoter directing the GUS expression.2.5 Dot-blot hybridization analysisGenomic DNA was extracted after cultivating in the glucose medium as described by the method of Penttilä et al [19]. The total DNA of the transformants were extracted and the dot blot analysis was performed with an ECL direct nucleic acid labeling and detecting kit (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) according to the manufacturer’s instructions. The amplified gus gene fragment using primers J and k was used as the probe.Table 1 The primers used in PCR amplificationprimer direction location sequenceAF*12278 to 2295(pNOM102 ) 5'-CGCCTCGAGTACCCCGCTTGAGCAGAC- 3' XhoIBR*24095 to 4113(pNOM102) 5'-GCGTCTAGA-TCATTGTTTGCCTCCCTG- 3' XbaIC F -1301 to -1287(cbh1 promoter) 5'–GCCCTGCAGAAAGCGTTCCGTCGCAGTAG-3' PstID R -35 to -16(cbh1 promoter) 5'-CGCGGTACCTTGACTATTGGGTTTCTGTG - 3' KpnIE F -868 to -851(cbh1 promoter) 5'-CGCCTGCAG-AGGCCTACCTGTAAAGCCGCAATG-3' PstI StuIF*3 R -742 to -725(cbh1 promoter)5'-ATTGGACTGAGTGAAG-AAGCCGTTGGCAAATTAC-3'G F -676 to -657(cbh1 promoter)5'-CTTCACTCAGTCCAATCTCA- 3'H R -637 to -620(cbh1 promoter)5'-GGAACAAACAAGCGACCC-3'I R -623 to -508(cbh1 promoter)5'-CTTTCACTTCACCGGA- 3'J F 709to726(GUS gene)5'-GTGAATCCGCACCTCTGG- 3'K R 1492 to 1509(GUS gene)5' -GGTGATGATAATCGGCTG- 3'L F -233 to -252(cbh1 promoter)5' -CTGAGGGTATGTGATAGGC- 3'M R 383 to 402(GUS gene)5' -GGCTTCAAATGGCGTATAG- 3'*1) Forward primer*2) Reverse primer*3) The first 16 bp fragment of primer F is complementary to the nucleotide sequence of G, the last 18 bp fragment is complementary to the -742 to -725 nucleotide sequence of cbh1 promoter2.6 RT-PCR analysisThe total RNA was extracted from freeze-dried mycelia. RT-PCR was carried out with primers J and K (Table 1) according to the protocol described by RT-PCR kit (Promega, USA). About 2µg of total RNA was used to synthesize the first strand cDNA with the reverse transcriptase (Promega, USA). The PCR reaction was performed as follows: 94℃ for 5min, then 30 cycles of amplification (94℃ for 30s, 53℃ for 1min, 72℃ for 1min), ending with 72℃ for 10 min.2.7 Semi-quantitative PCR analysisThe total DNA was extracted from the mycelia cultivating in 2% glucose medium. The PCR of GUS gene was carried out with primes J and K, with the housekeeping gene GAPDH gene as the inner control with primer5'-TCCGCAACGCTGTTGACAC-3';5'-TGGGACGGTTGTAGTTCACC- 3'. The PCR amplification was carried out in different tube but with the same parameters and reaction systems. The quantitative PCR data was analysed by the Gene tools from SYNGENE to detect the integrated optical density (IOD).2.8 Enzyme activity assayThe transformants were cultivated in 30 ml 2% (w/v) lactose medium for 2 days at 200 rpm, 28 °C. Then 2% (w/v) lactose was added once more, the transformants were cultivated for another 24 h to detect GUS activity [15]. To study the glucose repression/derepression effect, the transformants pC and ∆pC were first cultivated in 2% (w/v) lactose medium for 2 days, and then 2% (w/v) lactose ，and 2% (w/v) lactose and glucose were added into the medium respectively and cultivated for another 24 h to obtain the culture for the determination of GUS activity.3. Results3.1 Construction of the expression vectorThe expression vectors pL and pC with -869~-1301 region deleted (Fig. 1A) were constructed according to the method mentioned above. On the basis of the vector pC, the motif containing three CreI binding sites was deleted and the vector ∆pC was created (Fig. 1A).After PCR amplification and treatment with polymerase, the 200-bp DNA fragment (-620~-820 region) containing CCAAT box and Ace2 binding sites was inserted into the vector ∆pC, creating plasmid ∆p2C (Fig. 1B). Similarly, vectors ∆p4C and ∆p6C (Fig. 1B) carrying 4 and 6 copies of the 200-bp fragment were obtained respectively.3.2 Transformation and isolation of the T. reesei transformantsSix expression vectors were co-transformated with the pAN7-1 vector respectively according to the method mentioned above. Twenty Hygromycin-resistant transformants of every vector were obtained and cultivated in the glucose medium. These transformants were identified by PCR amplification that the gus gene was inserted into the chromosomal DNAs. The 800-bp PCR product with primers J and K (Fig. 2) was sequenced further confirming the existence of GUS gene in the chromosomal DNAs of the transformants. As was expected, the sequencing results of 654bp fragment with primers L and M (Fig. 3) contained partial sequence of cbh1 promoter and gus structure gene, confirmed the integration of the expression vector into the transformants genome. The complementary PCR results using the M13/pUC Reverse Primer and 5' –CTATACGCCATTTGAAGCC - 3' (gus gene) primer substantiated the modifications about the cbh1 promoter integrated into the transforments chromosomal DNAs (Fig was omitted).Thus, ten PCR-positive transformants of every vector was obtained. For the convenience of depiction, one from every ten PCR-positive transformants for each vector was selected and designated as T. reeseipL, pC, ∆pC, ∆p2C, ∆p4C and ∆p6C respectively.Fig. 1 Construction of GUS expression plasmids under modified cbh1 promoters 。
木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用[发明专利]
![木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3412b8579a6648d7c1c708a1284ac850ad0204a7.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710308495.8(22)申请日 2017.05.04(71)申请人 中国科学院上海生命科学研究院地址 200031 上海市徐汇区上海市岳阳路319号(72)发明人 周志华 刘睿 邹根 陈玲 江艳萍 (74)专利代理机构 上海专利商标事务所有限公司 31100代理人 陈静(51)Int.Cl.C12N 15/90(2006.01)C12N 15/80(2006.01)C12N 9/24(2006.01)C12N 15/113(2010.01)C12N 1/15(2006.01)C12P 19/14(2006.01)C12R 1/885(2006.01) (54)发明名称木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用(57)摘要本发明涉及一种木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用。
本发明人鉴定到一个木聚糖酶专性转录调控因子SxlR，其是木聚糖酶专性的负调控因子。
该基因敲除后的宿主菌中，木聚糖酶活提高而纤维素酶活不受影响。
可通过调控该基因的表达或活性，达到提高宿主菌中木聚糖酶的水解效率的目的。
权利要求书2页 说明书9页序列表7页 附图3页CN 108795988 A 2018.11.13C N 108795988A1.一种提高产生木聚糖酶的宿主菌中的木聚糖酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括：在所述的产生木聚糖酶的宿主菌中下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性包括：敲除或沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因，或抑制木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过采用同源重组的方法，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。
康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达
康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达黄时海;李湘萍;康超;黄飞;曹喜秀;何鑫平;汪晟;吴孔阳;曹普美;梁智群【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2011(000)002【摘要】将康氏木霉(Trichoderma koningii)总RNA反转录成cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR,合成约1.5kb的纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh I)基因.cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白.实验结果:cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达,重组蛋白pNPC 酶活为15.6U/L,最适反应温度为45℃,最适pH值为5.0,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为70kDa.【总页数】5页(P76-80)【作者】黄时海;李湘萍;康超;黄飞;曹喜秀;何鑫平;汪晟;吴孔阳;曹普美;梁智群【作者单位】广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学动物繁殖研究所,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;南宁新技术创业者中心,广西,南宁,530007;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005【正文语种】中文【中图分类】Q753【相关文献】1.绿色木霉纤维素酶CBHI基因的克隆与原核表达 [J], 任大明;毕霏;陈红漫;阚国仕;马艳;李艳秋;于可济2.康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究 [J], 黄时海;梁智群;李湘萍;康超;黄飞;汪晟;吴孔阳;曹喜秀;曹普美;何鑫平3.海洋微生物纤维素酶及半纤维素酶基因克隆与表达研究进展 [J], 刘杰凤;马超;王春;董宏坡4.微紫青霉CBHI酶的CBD蛋白编码区在大肠杆菌中的亚克隆及表达 [J], 汪天虹;王春卉5.康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因与乳酸菌非抗性穿梭表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达 [J], 刘燕;张宏福;孙哲;杨琳;王瑞军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达
CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达曾敏;邓丽瑜;汤新;刘刚;余少文【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2015(000)013【摘要】重构基因cbh2-linker-CDeg4表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶CBH II和内切葡聚糖酶EG IV 2种催化活性，在纤维素降解等方面有着重要应用。
本研究通过overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶（PDC）的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、重构基因cbh2-linker-CDeg4和pdc终止子依次连接，以质粒pPICZαA为基本骨架，构建表达载体pPIC-PCT。
采用原生质体转化法将pPIC-PCT和含潮霉素抗性筛选标记的质粒pAN7-1共转里氏木霉。
SDS-PAGE分析表明，重构基因cbh2-linker-CDeg4实现了在里氏木霉中的组成型表达，测得重组木霉发酵上清液的CMCNa酶活最高达到4.08 U/mL，是出发菌株的5.55倍，FPA酶活达到0.915 U/mL，较出发菌株提高了43.6%。
酶学性质初步研究表明：粗酶液的最适pH为5.0，最适温度为50℃。
【总页数】5页(P114-117,138)【作者】曾敏;邓丽瑜;汤新;刘刚;余少文【作者单位】深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060; 深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060;深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060;深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060;深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060;深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060【正文语种】中文【相关文献】1.里氏木霉组成型表达siRNA干扰cre1基因对纤维素酶表达的调控作用 [J], 高云雨;钟路遥;董冠园;佘伟怡;周娇娇;刘思远;田生礼2.用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因 [J], 易国辉;屠发志;张爱联;张添元;屈直;罗进贤3.烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因在大肠杆菌中的表达 [J], 杨海峰;魏亚琴;杨宇泽;万学瑞;孙康永杰;成述儒;王川4.微紫青霉CBHⅠ基因(Cbh1)在体外无细胞系统中的表达 [J], 王景林;高培基5.康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因与乳酸菌非抗性穿梭表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达 [J], 刘燕;张宏福;孙哲;杨琳;王瑞军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东【摘要】[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2014(045)010【总页数】5页(P1739-1743)【关键词】里氏木霉;纤维素酶;纤维二糖水解酶基因;分子改造;碱基突变【作者】陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东【作者单位】广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007【正文语种】中文【中图分类】Q7850 引言【研究意义】地球上每年光合作用的产物主要为植物枝、干、叶等木质纤维素类物质，产量高达1500多亿t。
近年来，如何利用这些纤维素资源来生产燃料乙醇成为研究热点。
有研究发现，微生物产生的纤维素酶可以将纤维素降解为葡萄糖，进而发酵生产乙醇（孙永明等，2006）。
纤维素酶不是单种酶，按照催化功能分为内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）及β-葡萄糖苷酶（BG），这3种酶协同作用才能将纤维素降解为葡萄糖。
cbh1是里氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的主要基因之一，其编码的纤维二糖水解酶（CBH）是纤维素水解酶系中作用于结晶纤维素的关键酶组分，能够从结晶纤维素的还原端连续催化切下纤维二糖单位，在纤维素水解过程发挥重要作用。
由于天然产生的纤维素酶活性较低，难以满足工业生产要求，因此对里氏木霉的纤维二糖水解酶编码基因cbh1进行人工改造，对提高纤维素酶活性具有重要意义。
【前人研究进展】近年来，许多学者对纤维素酶进行分子改造研究。
有研究发现，用定点突变的方法改造cbh1，可以提高纤维二糖水解酶作用于无定型纤维素和结晶纤维素的活力（von Ossowskil et al.，2003）。
对里氏木霉内切葡聚糖酶EGⅢ的编码基因进行随机突变和定突变，不仅能使酶活得到提高（Xiao et al.，2002），还可使酶的最适pH发生改变（Wang et al.，2005）。
在cbh1启动子调控下过表达cbh2基因，均可提高菌株的滤纸酶活和纤维二糖水解酶活（Fang and Xia，2013）。
用随机突变的方法改造里氏木霉cre1基因，可使突变菌株的表型发生改变从而提高其纤维素滤纸酶活（陈小玲等，2014）。
【本研究切入点】目前，对里氏木霉纤维素酶分子改造的研究主要集中在内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，鲜见有关cbh1分子改造的研究报道，对里氏木霉cbh1进行随机突变能否提高纤维素酶活性有待进一步研究。
【拟解决的关键问题】采用分子改造的方法随机改造里氏木霉纤维二糖酶基因cbh1，将改造的cbh1基因转入里氏木霉，通过比较滤纸酶活的方法筛选纤维素酶活提高的突变菌株，并在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1基因序列，以期为工业化生产纤维素酶提供参考。
1 材料与方法1.1 试验材料供试里氏木霉购自中国科学院微生物研究所菌种保藏室。
供试试剂：限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于Promega公司，琼脂糖购于Sigma公司，胶回收和PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR反应所用的酶及试剂、DNA分子量标准DL2000及DNaseI购自Fermentas公司，其他试剂均为国产分析纯。
PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
涉及的培养基有PDA培养基、CM培养基及MENDEL培养基（陈小玲等，2011），所有培养基均采用高压蒸气灭菌，含葡萄糖的培养基在115℃灭菌15 min，其他培养基在121℃灭菌20 min。
1.2 试验方法1.2.1 里氏木霉cbh1基因克隆及改造用PDA培养基培养里氏木霉，3 d后收集菌丝体采用CTAB法（吴志红等，2001）提取总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。
用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列为F（5'-TGCCATCAACCGATACTATG-3'）和R（5'-GGCACTGAGAGTAGTAAGGG-3'）。
以里氏木霉总DNA为模板，按陈小玲等（2011）的方法和反应体系扩增cbh1基因。
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；98℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃10 min。
将PCR产物保存于-20℃冰箱。
采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
将经过测序验证的cbh1基因片段用DNaseI消化5~30 min，以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。
通过胶回收纯化100 bp左右的DNA片段，用T4 DNA连接酶进行连接。
以连接产物为模板，按照上述方法进行PCR扩增，PCR 产物即为改造后的cbh1基因片段，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并将剩下的PCR产物保存于-20℃冰箱。
1.2.2 里氏木霉突变体库的构建及突变体筛选将里氏木霉孢子转接于PDA斜面培养基，于30℃培养至表面长满孢子，用无菌水将孢子洗下，并用600目纱布过滤，将滤液转接于CM培养基，在30℃、160 r/min条件下培养约16 h，收集里氏木霉菌丝体，参照艾云灿等（1993）的方法制备里氏木霉原生质体。
将改造的cbh1基因片段转化至里氏木霉原生质体（陈小玲等，2011），获得里氏木霉cbh1基因突变体库。
将突变体培养于刚果红平板培养基（MENDEL），挑选相对水解圈较大的菌株划线培养3次；接入CM培养基（用蔗糖代替葡萄糖）于30℃、160 r/min条件下培养2~3 d，所得上清液即为粗酶液。
取小试管，加入50 mg卷成“M”状的新华一号滤纸条，加入2 mL柠檬酸缓冲液（pH 4.8）和2 mL粗酶液，于50℃酶解1 h。
采用二硝基水杨酸（DNS）法测定酶解反应后反应液的还原糖含量（Adney and Baker，1996），计算菌株纤维素酶的滤纸酶活（FPA）。
由于通过紫外分光光度计测得的吸光值（OD）与还原糖含量或酶活性呈线性关系，即突变体比出发菌株还原糖含量或酶活性提高的倍数与OD提高的倍数一致，因此以OD提高的倍数作为突变体比出发菌株酶活性提高的倍数。
每批次挑选约20株菌株测定滤纸酶活，对酶活提高的突变体划线传代培养3次后，再次测滤纸酶活，筛选酶活提高的突变体。
酶活提高倍数=［（BE2-1-AE2-1）－（BCK-ACK）］/（BCKACK）式中，Ai为无滤纸的吸光值，Bi为有滤纸的吸光值。
1.2.3 里氏木霉突变体序列测序对酶活提高的里氏木霉突变体提取总DNA，按1.2.1的方法克隆突变体的cbh1基因，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并利用NCBI的GenBank数据库（）进行序列比对分析。
2 结果与分析2.1 里氏木霉cbh1基因克隆及分子改造琼脂糖凝胶电泳结果显示，克隆获得约600 bp的基因片段（图1），测序结果显示该片段大小为637 bp（图2）；在NCBI上进行序列比对分析，发现克隆获得的基因片段与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88%~98%（表1），表明克隆获得了里氏木霉cbh1的基因片段。
用DNaseI消化cbh1基因，经琼脂糖凝胶电泳分析，发现消化15 min得到的片段大小比较合适，将这些片段用T4 DNA 连接酶连接，并以连接产物作为模板，经PCR扩增获得改造后的cbh1基因，由不同大小的基因片段组成，模板浓度越高，扩增获得的大片段越多，琼脂糖凝胶电泳产生的片状拖带越长（图3）。
图 1 里氏木霉cbh1基因扩增片段Fig.1 Amplified fragmentcbh1geneofT.reeseiM：DL2000 DNA Marker；1：cbh1图 2 里氏木霉cbh1基因序列Fig.2 Sequence ofcbh1gene inT.reesei表 1 cbh1基因序列比对分析Tab.1 Nucleotide blast ofcbh1gene概述最大得分总分覆盖度（%） E值相似性（%）数据库编号Description Max score Total score Query cover E value Identity Accession康氏木霉cbh1基因1068 1068 97 0 98 X69976.1 T.koningii cbh1gene东方肉座菌EU7-22cbhI基因 723 723 97 0 88 JQ238604.1 Hypocrea orientalis strainEU7-22cbhIgene绿色木霉双功能脱乙酰几丁质酶—纤维素酶基因 723 723 97 0 88 FJ871063.1 T.viridebifunctional chitosanase-cellulase gene，complete cds康宁木霉cbh1基因部分序列 717 717 97 0 88 JX103160.1H.koningii cbh1gene，partdal cds2.2 突变菌株的筛选及序列分析将改造后的cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体，得到cbh1基因突变体库。