小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
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医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
1 2 3
9
10
可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
8 6
7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
1
2
3
4
5
6
7
8
9
可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
五年制免疫实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新
E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细 胞具有易粘附特性， 将淋巴细胞悬液加 到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时 后，洗脱的为非粘 附性T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤维 毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
一 、 T细 胞 增 殖 试 验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验 原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
2.
3 H-TdR掺 入 法 T细胞增殖试验 原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
小鼠脾脏单个核细胞分离
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。
T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测
淋巴细胞转化试验
细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验
T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测
细胞生物学方法: CK细胞敏感株
密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092
在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 2．空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
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➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
18
不同细胞密度不同
19
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
20
密度梯度离心法
血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 离心后
21
实验五 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
10min。弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置 3~4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以 1500rpm离心10min； 3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个 核细胞悬液。
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
1
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大 细胞、干细胞。
2
3
免疫细胞分离方法：
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质：
1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度 法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过 10%。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应 先做红细胞计数
人类NK细胞表面标志主要以CD16、 CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细 胞。
7
FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息 处理系统和细胞分离纯化系统组成。
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒 （如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞 生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一 体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞， 其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合 溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,•各种血液成 分将按密度梯度重新分布聚集。
17
不同细胞密度不同
基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
11
12
13
免疫磁珠法细胞分选过程
14
免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
15
全自动细胞分选系统
16
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 人外周血单个核细胞(peripheral blood
将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率 和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h) 的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活 性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
➢ CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
5
B细胞表面标志
中浸泡3~5min； • 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界
处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 膜组织。
取脾脏
24
实验步骤：
（二）制备单个核细胞悬液： 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指
套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心
22
解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆 盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积 较大，长条形态，属于外周免疫器 官。外周血中淋巴细胞可经再循环 驻入脾脏等外周免疫器官的特定区 域，所以富含各类免疫细胞。
23
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： • 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液
25
实验步骤：
（三）计算细胞浓度 1. 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释； 2. 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞
总数； 3. 计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀 释倍数。
26
计数池
正面观
支持堤
侧面观
支持堤 计数池 支持堤 1mm （0.1mm缝隙）
8
荧光激活细胞分离仪分离法
9
流式细胞分析仪
10
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚 合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即 可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
6
NK细胞表面标志
27
计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则
28
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡
或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数
下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
29
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要 重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得 超过5%。
18
不同细胞密度不同
19
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
20
密度梯度离心法
血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 离心后
21
实验五 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
10min。弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置 3~4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以 1500rpm离心10min； 3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个 核细胞悬液。
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
1
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大 细胞、干细胞。
2
3
免疫细胞分离方法：
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质：
1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度 法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过 10%。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应 先做红细胞计数
人类NK细胞表面标志主要以CD16、 CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细 胞。
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FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息 处理系统和细胞分离纯化系统组成。
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒 （如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞 生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一 体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞， 其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合 溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,•各种血液成 分将按密度梯度重新分布聚集。
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不同细胞密度不同
基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
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免疫磁珠法细胞分选过程
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免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
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全自动细胞分选系统
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密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 人外周血单个核细胞(peripheral blood
将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率 和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h) 的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活 性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
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T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
➢ CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
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B细胞表面标志
中浸泡3~5min； • 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界
处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 膜组织。
取脾脏
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实验步骤：
（二）制备单个核细胞悬液： 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指
套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心
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解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆 盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积 较大，长条形态，属于外周免疫器 官。外周血中淋巴细胞可经再循环 驻入脾脏等外周免疫器官的特定区 域，所以富含各类免疫细胞。
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实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： • 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液
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实验步骤：
（三）计算细胞浓度 1. 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释； 2. 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞
总数； 3. 计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀 释倍数。
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计数池
正面观
支持堤
侧面观
支持堤 计数池 支持堤 1mm （0.1mm缝隙）
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荧光激活细胞分离仪分离法
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流式细胞分析仪
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MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚 合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即 可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
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NK细胞表面标志
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计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则
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细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡
或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数
下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
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红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要 重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得 超过5%。