非靶向蛋白组学定量技术
靶向质谱与非靶向质谱
靶向质谱与非靶向质谱
质谱是一种用于分析、鉴定物质的重要工具。
根据分析的目的和方法，质谱可以分为靶向质谱和非靶向质谱。
靶向质谱是指在事先已知待检测物质的情况下，采用特定的检测方法和仪器，对目标化合物进行定量和鉴定。
靶向质谱适用于定性分析和定量分析，例如药物分析、食品安全分析、环境监测等领域。
与之不同的是，非靶向质谱是一种无需先知待检测物质的情况下进行分析的方法。
非靶向质谱通过将样品分子分离、离子化，以质荷比为基础，通过高分辨率质谱分析技术进行分析，从而获得样品离子特征图谱，从而对样品进行分析和鉴定。
非靶向质谱适用于复杂样品的分析和鉴定，如生物样品、环境样品等。
在生物医学领域，非靶向质谱广泛应用于代谢物组学研究、蛋白质组学研究等。
靶向质谱和非靶向质谱在分析方法、仪器、应用领域等方面存在差异。
了解和掌握靶向质谱和非靶向质谱的特点和应用，对于有效开展质谱分析具有重要的意义。
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靶向蛋白组学定量和SWATH技术
靶向蛋白组学定量（MRM/SRM，PRM）和SWATH技术靶向蛋白组学定量非靶向蛋白组学定量技术受限于生物样本的复杂性，低丰度的多肽信号容易被高丰度的所抑制，因此难以检测低丰度的多肽，灵敏度低且具有随机性，定量的重复性也较低。
随着蛋白组学研究的深入，差异蛋白组学越来越受到人们的青睐，差异蛋白分析能发现潜在疾病标志物，加快代谢组学的临床应用步伐。
靶向蛋白组学定量（又被称为目标蛋白组学定量）技术可以弥补上述非靶向定量组学定量的不足，具有高通量、高准确性、可重复性的优点，基于早期的差异蛋白组/转录组/基因组的数据，在大生物样本量中，验证这些标志物。
靶向蛋白组学定量主要包括MRM/SRM和PRM。
靶向蛋白组学定量技术可用于信号传导通路检测、肿瘤标志物研究和翻译后修饰研究，是基于抗体的蛋白定量技术以外的另一种快速、高效蛋白靶向定量技术。
1. MRM/SRM多重反应监测技术(multiple reaction monitoring, MRM）在早期文献中又被称为选择反应监测技术（selected reaction monitoring，SRM）。
该技术本质上是一种质谱的扫描模式，基于目标蛋白的特定母离子和子离子对，选择采集符合目标离子规则的信号，去除不符合规则的信号干扰，进行高灵敏度、高准确性和特异性的靶向蛋白定量。
MRM 质谱分析主要包括三个阶段：（1）一级质谱扫描筛选出与目标分子特异性一致的母离子;（2）碰撞碎裂母离子，去除干扰离子；（3）只采集来自选定的特异离子的质谱信号。
可以基于理论预测（如MRMpilot等软件）或者真是实验结果选择母子离子对。
图1. 三重四极杆质谱仪进行MRM扫描示意图。
该技术最大限度排除了其他离子的干扰影响，显著提高了靶向肽段的信噪比和对目标肽段定性和定量检测的灵敏度和可重复性，被认为是基于质谱技术的蛋白定量的“金标准”，特别适合进行标志蛋白的高通量监控。
通过在样本中加入已知含量的同位素标记肽段作为内参，MRM技术还可用于目标蛋白的绝对定量。
蛋白半定量,定量,绝对定量
百泰派克生物科技
蛋白半定量，定量，绝对定量
在蛋白质分析中主要对定性分析和定量分析进行研究，定量分析就是对蛋白样品的含量进行鉴定，可以分为定量、半定量、相对定量和绝对定量。
蛋白定量很容易理解，那什么又是半定量、相对定量和绝对定量呢？今天小编就和大家聊聊这个问题。
蛋白定量就是对某蛋白样品进行精确的定量鉴定，其测定结果较接近真实值，可信度高。
通常利用标记（iTRAQ、TMT、SILAC等）或非标记（Label Free）策略进行
蛋白定量研究。
蛋白半定量不是指对一半的蛋白质进行定量研究，而是指在某些特殊情况下，如难以直接对蛋白质含量进行测定或蛋白含量易发生周期性波动时，只能对蛋白质的含量进行粗略的、大致的鉴定，所得到的结果是近似的测量值，精确度远不如定量分析。
蛋白相对定量，又称为比较定量，是将两种蛋白质在不同状态下的表达量或含量进行相对比较分析，常用于检测不同生理或病理状态下蛋白含量的变化。
蛋白绝对定量是对各类蛋白进行浓度或含量的绝对分析，可以对组织、体液或细胞蛋白质组中的每一种蛋白质进行绝对含量和浓度分析，是一种靶向定量蛋白组学技术，常用于蛋白质或其修饰状态的定量分析。
目前主要利用内标法或基于质谱的非标记方法进行蛋白绝对定量研究。
百泰派克生物科技基于高分辨率质谱仪结合丰富的生物信息学分析经验，提供高效精准的蛋白质定量服务技术包裹，能够实现蛋白质定量、半定量、相对定量、绝对定量、标记定量以及非标记定量等分析，欢迎免费咨询。
蛋白定量质谱
蛋白定量质谱质谱在普通的蛋白定量和蛋白质翻译后修饰研究中都已有广泛应用，已成为蛋白质组定量最主要的分析技术之一。
根据是否对目标蛋白进行定量可分为非靶定量和靶向定量。
非靶定量根据是否进行标记，又能分为非标记定量和标记定量。
一些根据科研临床需要保留下来的稳定又实用的蛋白定量质谱技术，仍然在不断完善和发展当中。
曾经宣传更广的能标记到8个样本的iTRAQ，目前已逐渐被能标记到16标的TMT超越。
而因为还要预先建库受到限制的DIA，技术已经成熟到能够放飞自我，不用预先DDA建库就可以进行鉴定，也已经能应用到磷酸化等修饰组学的分析当中。
下面就来汇总介绍一下当下蛋白非靶向定量主流技术的进展和应用。
非靶向定量蛋白质组学（Untargeted quantitative proteomics）技术是对样品中所有蛋白进行无差别的定量，方法有两类，标记和不用标记的定量。
>>标记定量在不同蛋白质样品中添加同位素标记，称为标记定量技术。
目前具有代表性的为体外化学标记的TMT（Tandem Mass Tag）技术。
①TMT原理标记定量的关键在标记试剂，用的是同位素的原理，通过将不同的同位素标签与肽段特异氨基酸位点相连实现不同来源的肽段标记。
TMT现在有6plex、10plex、11plex和16plex同位素标签，每种都有一个试剂盒，比如10plex就是包含了10种质量和化学结构相同、元素种类不同的同位素化合物（即同量异位素化合物）的标记，每个标记都由Amine Reactive group、Mass Normalizer和Mass Reporter组成。
Mass reporter用不同类型同位素形成几种分子量，Mass Normalizer进行分子量消减，保证每个标记Mass reporter相对分子质量和Mass Normalizer相对分子质量加起来是相等的。
比如3个质量报告基团相对分子质量分别是126、127、128，那质量调整区相对分子质量就是103、102、101，加起来都是229。
uplc-ms的非靶向代谢组学方法
非靶向代谢组学方法是一种用于发现并分析生物体内所有代谢产物的方法。
其中，uplc-ms（超高效液相色谱-质谱联用）技术被广泛应用于非靶向代谢组学研究中，因其高灵敏度、高分辨率和高通量的特点而备受青睐。
本文将重点介绍uplc-ms的非靶向代谢组学方法，包括样品处理、色谱分离、质谱检测、数据处理等各个方面。
1. 样品处理在非靶向代谢组学研究中，样品处理是非常关键的一步。
经典的样品处理方法包括蛋白沉淀、溶剂提取和衍生化等。
对于不同类型的生物样品，比如血浆、尿液、组织、细胞等，都需要选择合适的样品处理方法来提取代谢产物。
2. 色谱分离uplc-ms技术的另一个关键步骤是色谱分离。
通过超高效液相色谱技术，可以对样品中的代谢产物进行高效、快速的分离。
色谱柱的选择、流动相的配制、梯度 elution等因素都会影响色谱分离的效果，因此需要进行精心的设计和优化。
3. 质谱检测uplc-ms技术的核心是质谱检测。
通过质谱仪器的高灵敏度、高分辨率和高质谱质量的特点，可以对样品中的代谢产物进行快速、准确的检测和分析。
质谱仪器的参数设置、离子扫描模式的选择、质谱图的解释等都是影响质谱检测结果的重要因素。
4. 数据处理完成了样品处理、色谱分离和质谱检测后，还需要对得到的海量数据进行处理和分析。
包括峰识别、质谱图的定量和定性分析、多变量统计分析等，都需要借助专业的数据分析软件和统计学方法来完成。
总结uplc-ms的非靶向代谢组学方法在生物医学、药物研发、环境科学等领域都有着广泛的应用前景。
通过精心设计各个步骤，结合先进的仪器设备和专业的数据处理技术，可以更全面、更深入地揭示生物体内代谢变化的规律，为疾病诊断、药物研发等提供有力支持。
希望uplc-ms的非靶向代谢组学方法在未来能够得到更广泛的推广和应用。
uplc-ms的非靶向代谢组学方法在生物医学、药物研发、环境科学等领域的广泛应用中，为科研工作者提供了强大的工具和技术支持。
半定量 非靶向代谢组学
半定量非靶向代谢组学
非靶向代谢组学是指采用特定的技术（如LC-MS、GC-MS、NMR技术）无偏向性地检测细胞、组织、器官或生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。
这种代谢组学研究方法可以对机体或组织、器官甚至一个细胞的全部内源性代谢产物进行全面、系统、无偏向性的分析，从而获取尽可能多的代谢产物数据，有助于发现差异代谢物或者新的生物标志物。
至于“半定量”的概念，通常用于描述代谢组学中的一种分析方法，即相对于非靶向代谢组学的绝对定量方法而言，半定量方法可能只能提供相对定量的结果。
非靶代谢组
非靶代谢组引言非靶代谢组（non-targeted metabolomics）是一种高通量的代谢组学技术，可以在不预先设定特定分子进行分析的情况下，综合地鉴定和定量生物体内的代谢物。
与靶向代谢组学不同，非靶代谢组学无需事先确定分析目标，而是通过大规模筛查样本中的代谢产物，以发现新的代谢通路和生物标志物。
本文将对非靶代谢组的原理、应用领域、技术流程和数据分析进行详细介绍，并讨论其在医学、生物学和食品科学等领域的潜在应用。
原理非靶代谢组学主要基于质谱（mass spectrometry）技术，结合色谱（chromatography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance）等方法，实现对样本中代谢物的全面分析。
非靶代谢组学的分析流程包括样品制备、仪器检测和数据分析三个关键步骤。
首先，对样品进行适当处理，如提取、去蛋白和衍生化等，以增强代谢物的检测和分析能力。
然后，使用质谱等仪器对样品进行分析，将代谢物的质量-电荷比（m/z）和相对丰度信息记录下来。
最后，通过数据预处理、特征选择和统计分析等方法，对非靶代谢组学数据进行解析和解释。
应用领域非靶代谢组学在医学、生物学和食品科学等领域有着广泛的应用。
医学非靶代谢组学可以用于发现新的生物标志物，以辅助疾病诊断和预后评估。
通过比较病例组和正常对照组的代谢组学数据，可以鉴定与疾病相关的代谢异常，从而为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
例如，非靶代谢组学已被应用于癌症、糖尿病和心血管疾病等多种疾病的研究中，帮助揭示其潜在的代谢机制。
生物学非靶代谢组学可以揭示生物体内代谢网络的复杂性和动态性，帮助解析代谢通路和代谢互作网络。
通过对不同生理状态下的代谢物进行分析，可以揭示代谢通路的变化规律，并研究其与生物学功能和调控的关联。
此外，非靶代谢组学还可以用于研究植物代谢物的合成、植物应答环境胁迫的机制等。
食品科学非靶代谢组学可以用于食品质量和安全的评估。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
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非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT
定量蛋白组学的研究意义
人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。
这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。
但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。
其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。
而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。
定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。
基于质谱的蛋白质定量
20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。
图1. 生物质谱仪器。
利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略：
Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。
Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。
蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。
虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。
利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋
白组学。
标记定量
标记定量主要分为体内标记（SILAC）和体外标记（iTRAQ，TMT）。
1 SILAC
SILAC(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture) 的基本原理是通过培养，利用天然同位素（轻型）或者稳定同位素（中型/重型）取代相应氨基酸。
经过5-6次传代后，稳定同位素可以完全掺入到新合成的蛋白质中。
不同标记的细胞或者蛋白等比例混合后，引入质谱鉴定。
如果峰值呈现为1：1，则表示此蛋白的含量无差异。
如果含有重型氨基酸的峰值偏高，说明重型氨基酸标记的组中此蛋白含量更高。
SILAC的优点是蛋白标记效率高，传代6-8代后，可达到90%以上，灵敏性高。
可检测水平极低的蛋白含量变化和翻译后修饰，且样本需求量小，每个样本仅需几十微克，缺点是耗时长。
图2 SILAC原理和流程。
2 iTRAQ&TMT
iTRAQ（isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation）和TMT（tandem mass tag）是目前应用最广泛的蛋白质定量方法之一。
两个方法的原理类似，都是化学体外标记方法。
由于生产商不同（iTRAQ的生产商为为AB Sciex，TMT的生厂商为Thermo Fisher），所以标记规格和标签分子结构有差异。
这两种方法可检测出低丰度的蛋白，胞外蛋白，膜蛋白，胞浆蛋白，核蛋白等，
可同时处理多个样本，鉴定和定量的结果同时得出且准确，特别适用比较蛋白组分析，鉴定差异蛋白。
表1. iTRAQ和TMT标签的差异。
iTRAQ原理：首先蛋白质被裂解形成多肽，然后利用iTRAQ试剂进行差异标记。
iTRAQ 标签包含报告基团、平衡基团和肽反应基团。
不同标签的报告基团和平衡基团重量有差异，以4标为例，报告基团重量分别是：114，115，116，117Da，而平衡基团重量分别为31，30，29，28Da。
因此，标签的总重是一致的。
同一肽段由不同标签标记后具有相同的质荷比。
串联质谱中，碰撞诱导质量平衡集团丢失，因此同一多肽由于标签不同，产生不同的报告离子，根据报告离子的信号强度从而推断不同样品间相同肽段的含量。
图3 iTRAQ技术流程。
非标记定量
非标记（Label free）蛋白质定量利用液质联用技术将蛋白质酶解形成多肽后进行质谱分析，通过计算蛋白肽段的鉴定数目和色谱峰面积进行蛋白质相对定量。
该方法的优点是无需昂贵的标签做内标，且样本制作过程简单，由于操作步骤少，可尽量减少人为和系统误差。
但是数据分析相对标记定量而言难度更大更复杂，且重复性较差，对仪器的稳定性和重复性要求高。
通过在样本中添加已知含量的标准蛋白还可以实现绝对定量。
图4 Label-free蛋白定量流程。
参考文献：
1、代立朋. 基于液质联用法的蛋白绝对定量技术开发及其在单抗类药物临床前药代动力学研究中的应用[D]. 天津大学, 2014.
2、基于质谱的定量蛋白质组学技术发展现状[J]. 生物技术通报, 2017(9).。