粪大肠菌群检测
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群的测定
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
粪大肠菌群数测量方法-概念解析以及定义
粪大肠菌群数测量方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以描述该篇文章的研究背景以及粪大肠菌群数测量方法的重要性。
可以参考以下内容进行撰写：概述粪大肠菌群数（Fecal coliform count）是评估水体、食品和环境卫生安全的重要指标之一。
粪大肠菌群数测量方法的准确性和可靠性对于保障公众健康和环境质量至关重要。
随着生活水平的提高和环境污染问题的日益严重，对粪大肠菌群数测量方法的研究与探索变得尤为重要。
本文旨在详细介绍目前常用的三种粪大肠菌群数测量方法，即第一种测量方法、第二种测量方法和第三种测量方法。
通过比较这三种方法的原理、步骤以及各自的优缺点，可以帮助读者更全面地了解和选择合适的测量方法。
本文结构本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分对粪大肠菌群数测量方法的研究背景和意义进行了概述。
正文部分详细介绍了三种测量方法的原理、步骤以及优缺点。
结论部分对本文的主要观点进行总结，并对未来相关研究进行展望。
通过本文的阅读，读者可以对粪大肠菌群数测量方法有一个全面的了解，并对选择适合自己研究对象的测量方法具备一定的指导意义。
希望本文能够为相关领域的研究工作者提供有价值的信息和启示，推动粪大肠菌群数测量方法的改进和发展。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括对整篇文章的大致框架进行介绍，即各个章节及其内容的概览。
在文章结构部分中，可以简要介绍文章的组成和布局，以帮助读者更好地理解整篇文章的结构和内容安排。
此外，可以提及各个章节的主要目标和内容，以及各个章节之间的逻辑关系。
具体编写文章结构部分的内容如下：文章结构：本文共分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要概述了本文的研究背景和目的，同时简要介绍了大纲中各个章节的内容安排。
正文部分详细介绍了三种粪大肠菌群数测量方法：第一种测量方法、第二种测量方法和第三种测量方法。
每种测量方法都包括了原理、步骤和优缺点的详细介绍。
通过对这三种测量方法的讨论和比较，读者可以全面了解不同测量方法的特点和应用情况。
粪大肠菌群的测定
粪大肠菌群的测定1 卫生学意义粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。
因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。
2 检验方法2.1 术语与定义一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。
2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：46℃±1℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
2.3 培养基和试剂（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：2.75g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g；蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.22）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
（2）EC肉汤（E.coli，BGLB）：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：4.0g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：1.5g；氯化钠：5.0g；蒸馏水：1000mL；pH：6.9±0.1。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
GB18466粪大肠菌群验证报告
方法验证报告项目名称：粪大肠菌群的测定方法名称：GB 18466-2005粪大肠菌群的检测方法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2 实验室检测技术能力2.1样品采集与保存按照HJ 91.1的相关规定进行水样的采集。
采集样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。
水体采样量不低于200 ml。
样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。
采集废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。
如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125mL容积加入0.1g/ml的硫代硫酸钠0.1mL）。
采样后应在2 h内检测，否则，应10⁓以下冷藏但不得超过6 h。
实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4⁓以下冷藏并在2 h内检测。
2.2 检测步骤2.2.1样品准备污水样品至少取200ml，使用前应充分混匀。
根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确认污水样品接种量。
粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10、1、0.1ml。
粪大肠菌群较多时接种量为1、0.1、0.01ml或0.1、0.01、0.001ml等。
接种量少于1ml时，水样应制成稀释样品后供发酵实验使用。
接种量为0.1、0.01ml时，取稀释比分别为1:10、1:100.其他接种量的稀释比依此类推。
1:10稀释样品的制作方法为：吸取1ml水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。
耐热大肠菌群粪大肠菌群快速检测（酶底物法）
耐热⼤肠菌群粪⼤肠菌群快速检测（酶底物法）1 适⽤范围本⽅法适⽤于⽣活饮⽤⽔及其⽔源⽔、地表⽔、污⽔、废⽔等⽔中粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群）的定性检测、定量检测2 ⽅法原理固定底物酶底物法（DST）采⽤⼤肠菌群细菌能产⽣β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄⾊的原理，来判断⽔样中是否含粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群），粪⼤肠的培养温度是44.5℃。
3 仪器设备3.1 程控定量封⼝机3.2电热恒温培养箱3.3 冰箱3.4 51孔定量盘、97孔定量盘3.5 100ml⽆菌⽔样瓶3.6 ⾼压蒸汽灭菌锅3.7 ⼲热灭菌器3.8 量筒3.9 吸管3.10 试管4 培养基和试剂4.1 科⽴得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基4.2 ⽆菌⽔5 样品的采集和保存5.1采样前准备：5.1.1 采样瓶：采⽤IDEXX公司科⽴得系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。
5.2 样品采样及注意事项5.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，⽆论在什么条件下采样时，均要⼩⼼开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶⼦颈部受杂菌污染，并注意在使⽤船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。
5.2.2 在采集江、河、湖、库、地表⽔样时，可握住瓶⼦底部直接将采样瓶插⼊⽔中，约距⽔⾯10~15厘⽶处，瓶⼝朝来⽔⽅向，使⽔样灌⼊瓶内。
如果没有⽔流，可握住瓶⼦⽔平前推，直⾄充满⽔样为⽌。
采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采样后，采样瓶内上部应留有⼀些空隙，以便检验前充分混匀⽔样。
5.2.3 ⽤采样器采样时，将⽆菌的⽔样瓶放⼊架内。
将采样装置放⼊⽔中。
到达预定深度后，打开瓶塞，待⽔样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。
再将整个装置提出⽔⾯。
5.2.4 从⾃来⽔龙头采集样品时，不要选⽤漏⽔的龙头，采⽔前可先将⽔龙头⽤酒精灯⽕焰灼烧灭菌或⽤70%的酒精溶液消毒⽔龙头及采样瓶⼝，然后将⽔龙头完全打开，放⽔数分钟后除去⽔管中的滞留杂质。
采⽔时控制⽔流速度⼩⼼接⼊瓶内。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
粪大肠菌群检测
一、室所用设备、器皿
1、无菌区工作台
2、恒温培养箱
3、高压蒸汽灭菌器
4、冰箱
5、酒精灯
6、天平
7、电炉
8、采样广口瓶
9、烧杯、玻璃棒
10 、玻璃发酵管
11、试管架
12、移液管
13、锥形瓶
二、药品：乳糖胆盐培养基
三、前期准备
1、玻璃器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）
所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、锥形瓶等玻璃器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管、移液管、玻璃棒：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
2、采样
采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。
采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。
四、实验步骤（多管发酵法）
1、配制乳糖胆盐培养基试制
（注：做15管的话，10ml的要配双料的，如：30g配1000ml，就应称取60g配1000ml，其他1ml、0.1ml的配制成单料的）,配制试剂时不用定容，只需大概体积即可。
2、称取12g乳糖胆盐培养基溶于200ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。
（5管10ml）
3、称取6g乳糖胆盐培养基溶于100ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。
（10管10ml）
5、所有发酵管盖好盖子，包裹好置于高压锅灭菌15 分钟（第一次曝气开始计时）
6、分别加入5管10ml、5管1ml、5管0.1ml的水样于已冷却至室温的发酵管中，并置于恒温培养箱里培养24小时（温度为44.5℃）
五、结果
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从MPN表中查得相应的MPN指数，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值。