实验1叶绿体的分离与荧光分析
叶绿体的分离与荧光观察
实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。
分离过程最好在0〜5C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。
三、实验步骤1. 选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCI溶液，匀浆3〜5min。
2. 匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。
3•将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
4•将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清，沉淀即为叶绿体。
5. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。
6. 撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。
四、结果与分析参考文献《细胞生物学实验》李玲李雪峰着湖南科学技术出版社百度文库《叶绿体的分离与荧光观察》。
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。
试验1细胞大小测定
《细胞生物学》实验（养殖：1——3；生技、海科：1——6）实验一细胞器的分离、提取与测量【目的】掌握叶绿体分离的一般原理和方法，学习用测微尺测量细胞与细胞器大小的测定方法，并了解应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【原理】叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。
利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4mol／L蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。
将匀浆液在1000r／min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
在室温下进行分离要迅速。
用显微测微尺可以直接测量细胞大小，精确度较高。
显微测微尺分为物镜测微尺和目镜测微尺2种。
目镜测微尺是1块小玻璃圆片(可放人目镜内，其大小正好卡人目镜筒内)，在圆片正中央刻有1cm长的直线，直线上均匀分为100小格或50小格，每小格的长度，随目镜和物镜的放大倍数而变动。
物镜测微尺是一块特制的玻璃载片，载片中央刻有一条1mm长的直线，均匀地刻分为100个小格，每小格为1／100mm (为10μm)，用一小圆形玻璃盖片封盖着，物镜测微尺较目镜测微尺小格的间距精确，通过目镜测微尺测量细胞与细胞器的大小(小格数)，然后换以物镜测微尺校测小格数的精确数值，即为测量的细胞与细胞器大小结果。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。
【材料】菠菜叶片。
【实验用品】1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01% 吖啶橙。
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22Ⅰ提取与分离一、实验目的：1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂:1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。
3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、实验步骤:（一）色素提取液的制备1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。
2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。
提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。
（二）叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。
实验1 叶绿体的分离与荧光观察
中国海洋大学实验报告2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察一、实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理1.将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
2.叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
3.因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。
三、实验用品1.材料：新鲜菠菜。
2.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
3.器材：(1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
(2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。
四、实验步骤与方法一、叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2.低速匀浆3~5min。
3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。
6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。
7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。
(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
二、菠菜叶手撕片观察轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
叶绿体的荧光染色与观察
姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等2. 材料：新鲜菠菜3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察迅速分离和观察。
II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。
III.①荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。
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中国海洋大学实验报告姓名：系年级：**级专业：生物科学
科目：分子细胞生物学实验学号：**
一、实验目的：
（1）、通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法
（2）、观察叶绿体的间接荧光，并了解荧光显微镜的使用方法
二、实验原理
颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，一次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小。
密度的先后分批沉降在离心管的底部分批收集，即可获得各个亚细胞的组分。
叶绿体的分离应该在等渗溶液中进行，以免渗透压影响叶绿体，对其造成损伤。
在荧光显微镜下可以观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。
三、实验材料
新鲜菠菜。
等渗溶液：0.35mol/L氯化钠溶液，
试剂：0.01%吖啶橙(acridine orange)
四、实验方法
１、叶绿体的分离
2、菠菜叶手撕片的制备
①、下表皮因海绵组织较疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在显微镜下观察。
②、上表皮因栅栏组织较致密，可以用刀片将下表皮刮掉，在显
微镜下观察上表皮的细胞和气孔。
3、菠菜的叶绿体的观察
在普通光学显微镜下，将制得的手撕片放在载玻片的等渗溶液中，游离的叶绿体悬浊液点在在载玻片上，轻轻地盖上盖玻片（防止气泡
产生），即可观察。
在荧光显微镜下，将游离叶绿体悬浊液的的标本放在荧光显微镜下，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察其产生的自发荧
光。
向手撕片的标本、游离叶绿体悬浊液的的标本中加入1-2滴
0.01% 吖啶橙染液，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察
其产生的间接荧光。
五、实验结果
气孔保卫细胞
叶绿体
图1菠菜手撕片的标本中，上表皮及其气孔
图2菠菜手撕片的标本中，下表皮及其气孔图3叶表皮在绿光照射下的间接荧光
游离叶绿体保卫细胞
表皮细胞叶肉细胞
气孔
游离叶绿体
图 4叶表皮在蓝光照射下的间接荧光
图 6 游离叶绿体在绿光照射下的间接荧光
图 5游离叶绿体在蓝光照射下的间接荧光
气孔保卫细胞
游离叶绿体 表皮细胞。