龙牙葱木皂苷对培养心肌细胞游离钙浓度的影响

收稿日期 : 2008 - 10 - 23 修回日期 :2008 - 11 - 05 作者简介 : 张雨薇 ( 1979 - ) ,女 ,助教 ,从事心血管生理学研究 。
(LD - 42 北京) ;恒温磁 力搅拌器 ( SAK URA 日本 ) ; 电 ( ) 子天平 modelJD200 - 3 沈 阳 ; 共 聚焦荧 光显微 系统 (OLY MPUS 日本 ) 。 激光 共 聚 焦 扫 描 显 微 镜 (OLY MPUS FVΠ 500 型 LSCM) 共聚焦系统由 FLUOVIEW 软件控制图像处理软 件 ( IMAGE - PRO - PLUS 软件 ) 。 离心机 、 天平 、 培养瓶、 离心管 、 滴管 、 培养皿等均 为国产 , 所有玻璃器皿经次强酸 浸泡过夜 , 清水冲洗 10～15 遍 ,以彻底清除残留酸液 ,最后用蒸馏水冲洗 5 ～6 遍 , 烤干后高压灭菌备用 。 113 实验动物 原代培养心肌细胞来自出生 1 ～3 天 Wi star 大乳鼠 ,Wistar 大乳鼠由吉林大学基础医学院动 物中心提供 。 114 新生大鼠心室肌细胞培养 Wistar 大乳鼠 , 雌雄 不拘 ,心肌细胞的 培养方法参 照文献[ 9 - 12 ] , 并稍 做修 改 。Wistar 大乳鼠脱臼处死 , 在无菌的条件下 ,75 %消 毒胸部皮肤迅速摘取心脏 , 置于预冷的 D - hank’ s液 中冲洗 3 遍 ,洗去血细胞 , 去除心房 , 将心室肌组织放 入三角烧瓶中 , 剪成大约 1mm3 的碎块 , 用 01125 % 的 胰蛋白酶 ,37 ℃水浴消化 8min , 收集细胞悬 液 ,1000rΠ min 离心 10min , 弃上清 , 用含 20 % 胎牛血清的 DME M 重悬心肌细胞。将未被消化的心肌细胞按上述步骤消 化 5～6 次 , 直至组织完全消化 , 收集细胞悬液 ,180 目 滤网过滤 ,37 ℃的 95 %O2 和 5 %CO2 孵箱孵 育 90 分 钟 , 进行差速贴壁以此来纯化心肌细胞 , 其中贴壁细胞 为成纤维细胞 ,未贴壁为心肌细胞 , 小心用吸管吸取尚 未贴壁的心肌细胞 ,接种于特制小玻璃平皿中 ( 用计数
中 医 药 学 报
22
6
Acta Chinese M edicine and Pharmacology
2009 年第 37 卷第 1 期 Vol137 ,No11 ,2009
板计数 , 接种密度为 1 × 10 Π ml ) ,继续在 37 ℃ 的 95 %O2 和 5 %CO2 孵箱孵育 ,36h 后换培养基 , 待生长至状态 良好 ,进行实验用 。 115 培养心肌细胞内钙离子的测定 11511 Fluo - 3Π AM 的负载 用 HEPES 溶液 ( 溶液中 2+ 去除 Ca ) 洗涤细胞 3 次 , 于室温避光条件下 Fluo - 3Π μmmoΠ AM ( 5 l ) 负 载 细 胞 30min ( Fluo - 3Π AM 预 先 按 1mmolΠ l 溶于二甲基亚砜中 ,混匀后冻存于 - 20 ℃ 作为 储备液 ) 于荧光显微镜下观察负载情况 ,如荧光强度较 低 , 适当延长负载时间 10～ 20min , 然后用 HEPES 溶液 洗去细胞外残余染料 。 11512 细 胞内 钙离 子的测 定 将 装有 Fluo - 3Π AM (5 μ ) mmolΠ l 负载心肌 细胞的培养皿置于载 物台上 , 常 温下测定所选定细胞的钙值 , 激光共聚焦显微镜观察 并连续动态扫描细胞内荧光强度的变化 , 与 Ca 结合 的 Fluo - 3 在波长 488nm 处激发 , 发射波长 526nm , 采 样频率 488Hz ,每个平皿中选 2～ 3 个视野 , 记录并采集 图像 ,经光电倍增管和数字传入式摄像机 , 输入高速度 计算机系统 , 计算细胞内平均荧光强度 ,以此来衡量细 胞内游离钙的水平 ,荧光强度越大 ,表示细胞内的游离 钙浓度越高 , 反之浓度越低 。 116 试验分组 培养 36h 的细胞放在倒置显微镜下 观察 , 视野清晰 , 细胞生 长良好 , 大部分细胞 有搏动 。 将这些细胞随机分为 (1) 正常对照组 , 未加任何处理因 μgΠ 素 ; ( 2) 终浓度 As10 ml 组 。 117 统计学处理 计数资料以均数 ± 标准差表示 ( � x ±s ) ,两组数据的比较采用配对 t 检验 。 2 结果 211 As 对心肌细胞内游离钙 [Ca
(黑龙江中医药大学生理教研室 ,黑龙江 哈尔滨 150040) 摘 要 : 目的 :观察龙牙葱木皂苷对培养心室肌细胞游离钙离子浓度的影响 , 旨在从细胞水平进一步证 μmmolΠ 明了 As 的正性肌力作用的机制 。方法 :采用特异性的荧光指示剂 Fl uo - 3Π AM ( 5 l ) 负载心肌细 胞 , 应用激光共聚焦显微镜观察并连续动态扫描细胞内荧光强度的变化 ,从而反映其对细胞内游离钙浓 度的影响 。结果 :As ( 10 μ gΠ ml) 明显增加培养乳鼠心肌细胞内的游离钙离子浓度 。Ca2 + 平均荧光强度明 显升高 , 与对照组相比 , P < 0101 ,差异显著。荧光强度比正常对照组增 30 % 。结论 :增加心肌细胞的钙 离子浓度 ,影响心肌兴奋 - 收缩藕过程 ,As 增加心肌细胞的收缩力 , 进而实现正性肌力作用 。 关键词 :龙牙葱木皂苷 ;游离钙浓度 ; 正性肌力 中图分类号 :R285. 5 文献标识码 :A 文章编号 :1002 - 2392 ( 2009) 01 - 0021 - 04 龙牙葱木 ( Aralosides ,As) 系五加科药用植物 , 盛产 于东北地区 , 其提取物的主要成为皂苷 [1 ] 。国内外报 道其药理学作用非常广泛 :具有抗炎镇痛作用 ,对变态 反应 ,对心血管系统的影响等多方面的作用[ 2 ,3 ] 。其心 [4 ] 血管作用主要表现在 ( 1) 抗心肌缺血作用 ; ( 2) 强心 作用 :通过离体蛙实验 , 麻醉猫 , 心力衰竭的犬 、 大鼠的 [5- 7] 模型上应用 As 均可观察到明显的强心作用 , 亦有 人在离体大鼠心脏采用 Langendorff 灌流的方法观察其 对收缩性的直接影响 [8 ] ,结果也观察到正性肌力作用。 但是以往没有实验从培养心肌细胞水平上研究。本研 究旨在从细胞水平上进一步研究其实现正性肌力作用 的机制 , 希望能够为该药的临床应用提供理论依据 。 1 材料和方法 111 主要试剂 DMEM 培养基 : 博大生 物公司 提供 ; 新生胎 牛血 清 :杭州四季青生物工程 材料有限公司 , 用 前 56 ℃ 灭 活半小时 ;胰蛋白酶 : Sigma 公司 ; 液体 :D - hank’ s液, 20 %高糖培养基 ,01125 % 胰蛋白酶溶液 ; HEPES ( Mm) 溶液 : NaCl 140 , KCl416 ,MgCl2 110 , G lucose10 , Hepes10 ; Fluo - 3Π AM :美国 Sigma 公司 ;DMSO ( 二甲基亚砜 ) : 美 国 Sigma 公司 。 112 仪器 超净工作台 ( 苏州净化公司 ) ; 倒置显微镜 (OLY M2 PUS 日本 ) ; 恒温培养 箱 ( Shell - lab250 美国 ) ; 离心机
2009 年第 37 卷第 1 期 中 医 药 学 报 Vol137 ,No11 ,2009 Acta Chinese Medicine and Pharmacology
21
龙牙葱木皂苷对பைடு நூலகம்养心肌细胞游离 钙 浓 度 的 影 响
张雨薇 ,孙世晓 ,姜海英 ,曲丽