Fluo_3荧光微量法测定人红细胞胞浆内游离钙离子浓度
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Na2 HPO4 0. 5 mmol/L , M gSO4 1. 0 mmol/L , CaCl2 1. 0 mmol/L ,无钙液成分 ( pH = 7. 4)为 NaCl 145 mmol/L , KCl
5. 0 mmol/L , Na2 HPO4 0. 4 mmol/L , KH2 PO4 0. 4 mmol/L , NaHCO3 4. 0 mmol/L , ( 3) 仪器 :日本岛津 SH lMADZURF2 1501荧光分光光度仪 ,美国 COULTER JT血细胞计数仪 , BECKMAN 200 series pH测量仪 。
关键词 :肌钙蛋白 ;高原红细胞增多症 ;高原病
肌钙蛋白 I( troponin I, Tn I) 、肌钙蛋白 C ( TnC)和肌 钙蛋白 T ( TnT)组成的复合物在肌肉收缩和舒张过程中 起重要 的 调 节 作 用 。大 量 的 临 床 研 究 证 实 , 心 肌 Tn I ( cTn I)为心肌损伤最特异 、最敏感的血清标志物之一 ,被 广泛应用于临床诊断和预后判断 ,如 :急性冠状动脉综合
参考文献
[ 1 ] 朱思云. 放射性同位素 45 Ca2 +示踪技术 [ J ]. 中华血 管病杂志 , 2000, 2: 28.
[ 2 ] Le2Quan2Sang KH , Devynck MA. Increased p latelet cytosolic free calcium in essential hypertension [ J ]. J Hypertens, 1986, 4: 5672574.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320291202 中图分类号 : R446. 1 文献标识码 : B
高原红细胞增多症患者血清肌钙蛋白 Ⅰ含量测定
王立萍 1 , 高 红 2 , 祁 钊 1 , 阿祥仁 1 , 周晶苹 1 (1. 青海省人民医院检验科 ,青海 西宁 810007; 2. 青海省临床检验中心 ,青海 西宁 810007)
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检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320290202 中图分类号 : Q582 文献标识码 : B
Fluo23荧光微量法测定人红细胞胞浆内游离钙离子浓度
[ 8 ] A rmando L , Thomas R , H inds, et al. Increased cy2 tosolic free calcium in red blood cell is associated w ith essential hypertension in humans [ J ]. Am J Hyper2 tension, 1993, 6: 7712779. (收稿日期 : 2004206228) (本文编辑 :龚晓霖 )
[ 5 ] M inta A , Kao J, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodam ine and fluorescein chromophores [ J ]. J B iol chem , 1989, 264: 81712 8178.
一 、材料和方法 1. 材料 ( 1 ) 研究对象 : 健康体检者 38 名 ,其中男 28名 、女 10名 ,年龄 19～68岁 。取坐位休息 5 m in后 ,用 立式血压计测量血压 3 次 ,取平均值 。收缩压 ( 15. 35 ± 0. 400) kPa,舒张压 ( 9. 60 ±0. 533) kPa; ( 2) 主要试剂 : Fluo23 Calcium indicator, Fluo23K+ salt, 42B r2A23187, B IO2 RAD公司产品 。RBC2HEPES成分 (pH = 7. 4)为 NaCl 145 mmol/L , KCl 5. 0 mmol/L , D 2Glucose 5. 0 mmol/L ,
[ 6 ] David D , Montenay Garestier T, Devynck MA. Fluo2 rescence mea2surements of free Ca2 + concentration in human erythrocytes using the Ca2 + 2indicator furu22 [ J ]. Cell Calcium , 1988, 9: 1672179.
征 (包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛 ,急性心肌梗死等 ) , 心肌炎 ,心肌损伤 (心脏手术 ) ,心肌损伤面积估计 ,某些 药物疗效观察等 [1 ] 。
高原红细胞增多症 ( HAPC)是一种常见的慢性高原 病 ,发生于久居或世居高原者 ,出现症状性的过度红细胞
作者简介 :王立萍 ,女 , 1966年生 ,主管技师 ,主要从事临床免疫学及肝炎病毒学研究工作 。
[ 4 ] Kalfakakou V , Simons TJB. Anionic mechanism s of zinc up take across the human red cell membrane [ J ]. J Physiol (Lond) , 1990, 421: 4852497.
2. 方法 (1) 静脉采血 2 m l,注入 EDTA 2K3 抗凝管 中 ,放置室温 , 1 000 r/m in离心 10 m in,小心分离膜及血 浆避免 损 失 RBCs。用 冷 生 理 盐 水 洗 3 次 以 上 , 每 次 1 000 r/m in离心 5 m in弃上清液 ,确保 RBC充分悬浮在盐 水中 ; (2) 取 5 μl制备好的 RBCs,加置 10 m l的 HEPES 液中 , 测 定 RBC 浓 度 为 0. 03 ×1012 /L , 取 100 μmol/L Fluo23荧光指示剂 10μl,边搅边滴进 RBCs HEPES液中 , 37 ℃避光暗处孵 30 m in; ( 3 ) 将与荧光指示 剂结合的 RBCs HEPES液移入 15 m l的圆锥型离心管中 , 800 r/m in 离心 10 m in,弃上清液 ,分离未与载体细胞结 合的荧光
石玉玲 , 习 松 (广州军区总医院检验科 ,广东 广州 510010)
关键词 :游离钙 ;荧光探针 ;高血压
近年来研究表明 ,高血压病患者血管平滑肌功能异 常主要与钙代谢有关 ,其中细胞内钙离子 ( Ca2 + )浓度增 加是导致血压升高的主要原因 [1 ] 。血小板内游离钙测定 已有较多报道 [2 ] ,在血小板的分离过程中易激活胞内花 生四烯酸代谢 ,形成血栓烷 A2 等物质 ,可促进血小板致 密小管中储存钙的释放 。而测定红细胞 ( RBC)中游离 钙 ,可较好地避免人为因素的影响 。 RBC胞浆钙 ( RBCs Ca2 + )测定方法有原子吸收光度法测定总钙量 [3 ] ,放射同 位素 45 Ca2 +示踪法 [1 ] ,但操作繁锁 ,受条件限制 。近来荧 光钙结合探针 Fluo23的出现 ,可直接测定 RBC内 Ca2 +浓 度 。避免血红蛋白干扰 ,该法特异性好 、微量 、准确 、无放 射性污染 ,便于临床样品常规检测 。
二 、结果 应用公式 Ca2 + = kd ×[ ( F - Fm in ) / ( Fmax - F) × ( E / T) ] ( nmol/L ) ( kd = 316 nmol/L ) [4 ] [注 : F =测定荧光 信号 , Fmax =渗透信号 , Fm in = 0 ( Ca2 + )信号 , E = ( Fmax - F) , T = ( Fmax - Fm in) ]计算细胞内 Ca2 +浓度 。测定正 常人 RBCs游离钙荧光检出峰见图 1。加离子载体 42B r2 A23187后 ,诱导细胞产生钙平衡 ,游离钙荧光信号增大 , 如图 2所示 。本研究测定 38 名血压正常体检健康者的 RBCs Ca2 + ,平均值为 90. 7 nmol/L。正常参考值范围 21. 6～120. 3 nmol/L ,分布范围见图 3。
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图 3 38名正常人 RBCs游离钙含量分布图
三 、讨论 实验证实应用 Fluo23荧光探针 ,测定 RBCs中游离钙
是方便可行的 。对研究细胞内有关离子钙的代谢提供了 一个可靠稳定的方法 。测定原理 : Fluo23以乙酰甲基酯即 Fluo23 /AM 的形式负载入 RBC[5 ] ,进入细胞后 ,胞浆内的 非特异性酯酶可将 Fluo23 /AM 水解为 Fluo23, 对胞浆内 Ca2 +有较强亲合力 。可形成 Fluo23 Ca2 + 结合物 ,与 Ca2 + 结合后 Fluo23的荧光性可增强 20 倍 。其光谱特性 、荧光 峰的检出分别在激发波长 490 nm 和发射波长 526 nm处 , 由于采用此波长 ,从而避免了血红蛋白和其他蛋白的干 扰 。有文献报道红细胞中的锌离子 ( Zn2 + )与 Fluo23结合 的亲和力高于 Ca2 + [6 ] 。 Kalfakakou等 [7 ]报道人 RBC内游 离 Zn2 + < 3 nmol/L ,因而不足以影响细胞中 Ca2 +的测定 。 本研究测定 38名血压正常体检健康者 RBCs Ca2 + 含量 , 平均测定值为 90. 7 nmol/L。正 常 参 考 值 范 围 : 21. 6 ～ 120. 3 nmol/L ,与国外有关报道一致 [8 ] 。
图 1 RBCs内游离钙含量荧光检出峰
图 2 加离子载体 42B r2A23187后荧光峰值
作者简介 :石玉玲 ,女 , 1953年生 ,硕士 ,主任医师 ,主要从事临床生化及分子生物学研究 。
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
素 ; (4) 小心移出 RBC载体 ,加入 2 m l HEPES液 ,并保持 在冰水中 ,测定 RBC终浓度约为 5. 5 ×1012 /L; ( 5) 应用 Shimadzu RF21501 荧光分光光度计测定 Ca2 + 浓度 ,激发 波长 490 nm ,发射波长 526 nm , Slit宽度 10 nm ,取 100 μl RBC悬 2 m in。 放石英杯进行比色 ,测定在 2 h内完成 ; ( 6) 加离子载体 42B r2A23187 ( Fmax)测定 ,取 100 μlRBC悬液加入 1. 4 m l HEPES液 ,加 10μl(3. 8μmol/L ) 42B r2A23187,摇匀 37 ℃ 平衡 2 m in,行荧光测定并记录结果 。
[ 3 ] Schrier SL , Johnson M , Junga I, et al. Calcium dis2 tribution w ithin human erythrocytes [ J ]. B lood, 1980, 56: 667.
[ 4 ] Haugland RD. Handbook of fluorescent p robes and re2 search chem icals [ M ]. 5 th ed. Eugen: Molecular p robes Inc, 1992. 122.
5. 0 mmol/L , Na2 HPO4 0. 4 mmol/L , KH2 PO4 0. 4 mmol/L , NaHCO3 4. 0 mmol/L , ( 3) 仪器 :日本岛津 SH lMADZURF2 1501荧光分光光度仪 ,美国 COULTER JT血细胞计数仪 , BECKMAN 200 series pH测量仪 。
关键词 :肌钙蛋白 ;高原红细胞增多症 ;高原病
肌钙蛋白 I( troponin I, Tn I) 、肌钙蛋白 C ( TnC)和肌 钙蛋白 T ( TnT)组成的复合物在肌肉收缩和舒张过程中 起重要 的 调 节 作 用 。大 量 的 临 床 研 究 证 实 , 心 肌 Tn I ( cTn I)为心肌损伤最特异 、最敏感的血清标志物之一 ,被 广泛应用于临床诊断和预后判断 ,如 :急性冠状动脉综合
参考文献
[ 1 ] 朱思云. 放射性同位素 45 Ca2 +示踪技术 [ J ]. 中华血 管病杂志 , 2000, 2: 28.
[ 2 ] Le2Quan2Sang KH , Devynck MA. Increased p latelet cytosolic free calcium in essential hypertension [ J ]. J Hypertens, 1986, 4: 5672574.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320291202 中图分类号 : R446. 1 文献标识码 : B
高原红细胞增多症患者血清肌钙蛋白 Ⅰ含量测定
王立萍 1 , 高 红 2 , 祁 钊 1 , 阿祥仁 1 , 周晶苹 1 (1. 青海省人民医院检验科 ,青海 西宁 810007; 2. 青海省临床检验中心 ,青海 西宁 810007)
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检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
文章编号 : 100122087 (2005) 0320290202 中图分类号 : Q582 文献标识码 : B
Fluo23荧光微量法测定人红细胞胞浆内游离钙离子浓度
[ 8 ] A rmando L , Thomas R , H inds, et al. Increased cy2 tosolic free calcium in red blood cell is associated w ith essential hypertension in humans [ J ]. Am J Hyper2 tension, 1993, 6: 7712779. (收稿日期 : 2004206228) (本文编辑 :龚晓霖 )
[ 5 ] M inta A , Kao J, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodam ine and fluorescein chromophores [ J ]. J B iol chem , 1989, 264: 81712 8178.
一 、材料和方法 1. 材料 ( 1 ) 研究对象 : 健康体检者 38 名 ,其中男 28名 、女 10名 ,年龄 19～68岁 。取坐位休息 5 m in后 ,用 立式血压计测量血压 3 次 ,取平均值 。收缩压 ( 15. 35 ± 0. 400) kPa,舒张压 ( 9. 60 ±0. 533) kPa; ( 2) 主要试剂 : Fluo23 Calcium indicator, Fluo23K+ salt, 42B r2A23187, B IO2 RAD公司产品 。RBC2HEPES成分 (pH = 7. 4)为 NaCl 145 mmol/L , KCl 5. 0 mmol/L , D 2Glucose 5. 0 mmol/L ,
[ 6 ] David D , Montenay Garestier T, Devynck MA. Fluo2 rescence mea2surements of free Ca2 + concentration in human erythrocytes using the Ca2 + 2indicator furu22 [ J ]. Cell Calcium , 1988, 9: 1672179.
征 (包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛 ,急性心肌梗死等 ) , 心肌炎 ,心肌损伤 (心脏手术 ) ,心肌损伤面积估计 ,某些 药物疗效观察等 [1 ] 。
高原红细胞增多症 ( HAPC)是一种常见的慢性高原 病 ,发生于久居或世居高原者 ,出现症状性的过度红细胞
作者简介 :王立萍 ,女 , 1966年生 ,主管技师 ,主要从事临床免疫学及肝炎病毒学研究工作 。
[ 4 ] Kalfakakou V , Simons TJB. Anionic mechanism s of zinc up take across the human red cell membrane [ J ]. J Physiol (Lond) , 1990, 421: 4852497.
2. 方法 (1) 静脉采血 2 m l,注入 EDTA 2K3 抗凝管 中 ,放置室温 , 1 000 r/m in离心 10 m in,小心分离膜及血 浆避免 损 失 RBCs。用 冷 生 理 盐 水 洗 3 次 以 上 , 每 次 1 000 r/m in离心 5 m in弃上清液 ,确保 RBC充分悬浮在盐 水中 ; (2) 取 5 μl制备好的 RBCs,加置 10 m l的 HEPES 液中 , 测 定 RBC 浓 度 为 0. 03 ×1012 /L , 取 100 μmol/L Fluo23荧光指示剂 10μl,边搅边滴进 RBCs HEPES液中 , 37 ℃避光暗处孵 30 m in; ( 3 ) 将与荧光指示 剂结合的 RBCs HEPES液移入 15 m l的圆锥型离心管中 , 800 r/m in 离心 10 m in,弃上清液 ,分离未与载体细胞结 合的荧光
石玉玲 , 习 松 (广州军区总医院检验科 ,广东 广州 510010)
关键词 :游离钙 ;荧光探针 ;高血压
近年来研究表明 ,高血压病患者血管平滑肌功能异 常主要与钙代谢有关 ,其中细胞内钙离子 ( Ca2 + )浓度增 加是导致血压升高的主要原因 [1 ] 。血小板内游离钙测定 已有较多报道 [2 ] ,在血小板的分离过程中易激活胞内花 生四烯酸代谢 ,形成血栓烷 A2 等物质 ,可促进血小板致 密小管中储存钙的释放 。而测定红细胞 ( RBC)中游离 钙 ,可较好地避免人为因素的影响 。 RBC胞浆钙 ( RBCs Ca2 + )测定方法有原子吸收光度法测定总钙量 [3 ] ,放射同 位素 45 Ca2 +示踪法 [1 ] ,但操作繁锁 ,受条件限制 。近来荧 光钙结合探针 Fluo23的出现 ,可直接测定 RBC内 Ca2 +浓 度 。避免血红蛋白干扰 ,该法特异性好 、微量 、准确 、无放 射性污染 ,便于临床样品常规检测 。
二 、结果 应用公式 Ca2 + = kd ×[ ( F - Fm in ) / ( Fmax - F) × ( E / T) ] ( nmol/L ) ( kd = 316 nmol/L ) [4 ] [注 : F =测定荧光 信号 , Fmax =渗透信号 , Fm in = 0 ( Ca2 + )信号 , E = ( Fmax - F) , T = ( Fmax - Fm in) ]计算细胞内 Ca2 +浓度 。测定正 常人 RBCs游离钙荧光检出峰见图 1。加离子载体 42B r2 A23187后 ,诱导细胞产生钙平衡 ,游离钙荧光信号增大 , 如图 2所示 。本研究测定 38 名血压正常体检健康者的 RBCs Ca2 + ,平均值为 90. 7 nmol/L。正常参考值范围 21. 6～120. 3 nmol/L ,分布范围见图 3。
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图 3 38名正常人 RBCs游离钙含量分布图
三 、讨论 实验证实应用 Fluo23荧光探针 ,测定 RBCs中游离钙
是方便可行的 。对研究细胞内有关离子钙的代谢提供了 一个可靠稳定的方法 。测定原理 : Fluo23以乙酰甲基酯即 Fluo23 /AM 的形式负载入 RBC[5 ] ,进入细胞后 ,胞浆内的 非特异性酯酶可将 Fluo23 /AM 水解为 Fluo23, 对胞浆内 Ca2 +有较强亲合力 。可形成 Fluo23 Ca2 + 结合物 ,与 Ca2 + 结合后 Fluo23的荧光性可增强 20 倍 。其光谱特性 、荧光 峰的检出分别在激发波长 490 nm 和发射波长 526 nm处 , 由于采用此波长 ,从而避免了血红蛋白和其他蛋白的干 扰 。有文献报道红细胞中的锌离子 ( Zn2 + )与 Fluo23结合 的亲和力高于 Ca2 + [6 ] 。 Kalfakakou等 [7 ]报道人 RBC内游 离 Zn2 + < 3 nmol/L ,因而不足以影响细胞中 Ca2 +的测定 。 本研究测定 38名血压正常体检健康者 RBCs Ca2 + 含量 , 平均测定值为 90. 7 nmol/L。正 常 参 考 值 范 围 : 21. 6 ～ 120. 3 nmol/L ,与国外有关报道一致 [8 ] 。
图 1 RBCs内游离钙含量荧光检出峰
图 2 加离子载体 42B r2A23187后荧光峰值
作者简介 :石玉玲 ,女 , 1953年生 ,硕士 ,主任医师 ,主要从事临床生化及分子生物学研究 。
检验医学 2005年第 20卷第 3期 Laboratory Medicine 2005, Vol 20. No 3.
素 ; (4) 小心移出 RBC载体 ,加入 2 m l HEPES液 ,并保持 在冰水中 ,测定 RBC终浓度约为 5. 5 ×1012 /L; ( 5) 应用 Shimadzu RF21501 荧光分光光度计测定 Ca2 + 浓度 ,激发 波长 490 nm ,发射波长 526 nm , Slit宽度 10 nm ,取 100 μl RBC悬 2 m in。 放石英杯进行比色 ,测定在 2 h内完成 ; ( 6) 加离子载体 42B r2A23187 ( Fmax)测定 ,取 100 μlRBC悬液加入 1. 4 m l HEPES液 ,加 10μl(3. 8μmol/L ) 42B r2A23187,摇匀 37 ℃ 平衡 2 m in,行荧光测定并记录结果 。
[ 3 ] Schrier SL , Johnson M , Junga I, et al. Calcium dis2 tribution w ithin human erythrocytes [ J ]. B lood, 1980, 56: 667.
[ 4 ] Haugland RD. Handbook of fluorescent p robes and re2 search chem icals [ M ]. 5 th ed. Eugen: Molecular p robes Inc, 1992. 122.