FMR1基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突及树突棘可塑性的研究

ＦＭＲｌ基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究１．４自制实验装置本实验所用小鼠胡须行为观察实验装置（参考文献３７）如图ｌ所示。

主要由以下物体组成：１、铝台及铝制滑道：铝台３个，其中一个为开始平台，另外两个为选择平台，高×长×宽均为２０．０ｃｍ×１８．０ｃｍ×８．Ｏｃｍ，铝台的表面铺有由同样材料制成的黑色光滑塑胶。

开始平台与２个选择平台间的距离可以通过平台在铝制滑道上的滑动进行调节校定。

２、铝制滑道，可为平台提供移动的轨道。

３、鉴别物体位于每个选择平台的前端并稍高于选择平台表面，由与上同样材料的黑色塑料圆柱制成。

鉴别表面分为粗糙和光滑两种。

粗糙的鉴别表面有沿着它长轴的螺纹，螺纹具有统一的深度和密度（１ｍｍ深度、５ｍｍ的间隙），光滑的鉴别表面不具有螺纹。

３、食物杯子１个，放在正确选择平台远端尽头，当试验中小鼠做了正确的选择时即可予以接近食物杯子获得食物奖赏。

图１小鼠胡须行为学观察实验示意简图Ｆｉｇ．１．ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｒａｗｉｎｇｏｆＳｕｒｆａｃｅ—ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎＴｅｓｔｔｏｏｂｓｅｒｖｅｗｈｉｓｋｅｒｂｅｈａｖｉｏｒ２、实验方法２．１实验动物模型的检测２．１．１小鼠尾组织基因组抽提法检测小鼠基因型剪取各只用于本实验研究的ＦＭ肛１基因敲除型和野生型小鼠尾组织约１００ｍｇ，剪碎后分别放置在于１０ｍ１洁净的匀浆器中，加入ＳＴＥ（Ｏ，ｌｍｏｌ／ｄｍ３ＮａＣｌ，１嗨幽出ｆｄ矗ＥＤＴＡ，１０ｍｍｏＭｍ３Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ，ｐＨ值８．Ｏ）１ｍ１后充分研磨，待尾组织完全研碎生成匀浆后转移到１．５ｍ１干净的离心管中，离心机２０００ｒｐｍ离心ｌＯ１２２．３胡须行为刺激的具体方法胡须行为刺激方法”１：胡须直接机械刺激法如图２所示。

此法操作如下：在昏暗、隔音的环境中放置一个圆柱体（直径３ｃｍ，高２０ｃｍ）。

开始实验前的一周，每天将老鼠放在圆柱体的顶端，当小鼠习惯呆在圆柱体的顶端后就不会跳下圆柱体或是乱动。

然后，我们每天同一时间将小鼠放在圆柱体的顶端后用一支长画笔的毛刷规律的刷动小鼠右侧面部的胡须，注意不要除碰左边面部的胡须，频率保持每分钟２次，每天２０分钟，刷完胡须后再将小鼠放回它们各自的笼子里饲养。

无刺激组小鼠也同样按上述方法训练后每天在同一时间将其放在圆柱体的顶端，同样用一支长画笔的毛刷规律的在距离小鼠右侧面部胡须一定距离的地方刷动，频率及时间同上述，以此作为无刺激组。

每天按照这种方法，予以连续刺激４周，于最后一次刺激完５个小时后将小鼠穿心灌注固定取左脑进行研究分析。

因此本实验共分为４组，每组４只小鼠：＞ＷＴ对照组（ＷＴｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｇｍｕｐ，ＷＴｃ）≯ｗＴ刺激组（ｗＴｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ伊ｏｕｐ，ｗＴｓ）＞ＫＯ无刺激组（ＫＯｕｍｒｅａｔｅｄｇｍｕｐ，ＫＯｃ）≯Ｋ０刺激组（Ｋｏｓｔ油ｕｌａｔｅｄｇｒｏｕｐ，ＫＯｓ）图２小鼠胡须直接机械刺激法示意箍图Ｆｉｇ．２．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｒａｗｉｎｇｏｆｗｈｉｓｋｅｒ５ｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅ２．４Ｇｏｌｇｉ染色１０％水合氯醛０．３５ｍＬ／１００９腹腔注射麻醉。

剪开胸腔充分暴露心脏行主动脉插管。

剪破右心耳即灌注Ｏ．９％生理盐水（ｐＨ７．３）１２０ｍＬ。

待流出液变清亮时换用４℃１％ＦＭＲＩ基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究结果１．实验小鼠模型检测１．１实验小鼠基因型鉴定Ｋ０和ＷＴ型小鼠尾组织ＤＮＡＰＣＲ扩增结果如图４所示：以Ｓ１和Ｓ２为引物，经ＰＣＲ在ｗＴ型小鼠扩增出约为５００ｂｐ大小的片断；以Ｍ２和Ｎ２为引物，经ＰＣＲ在ＫＯ型小鼠扩增出约为８００ｂｐ大小的片断。

ＫＯ和ｗＴ型小鼠脑组织ｍＲＮＡＲＴＰＣＲ扩增结果如图５所示：以Ｓ１和Ｓ２为引物，经ＲＴ—ＰＣＲ在ｗＴ型小鼠扩增出约为１２０ｂｐ大小的片断。

以Ｓｌ和Ｎ２为引物，经ＲＴＰＣＲ在ＫＯ型小鼠扩增出约为１１０ｂｐ大小的片断。

这是因为ＫＯ型小鼠在ＦＭＲｌ基因第５个外显子中插入了一个新霉素基因片断，导致正常ＦＭＲｌ基因及其转录的ｍＲＮＡ缺陷所致。

图４ＫＯ和ｗＴ型小鼠尾组织ＦＭＲＩ基因片断ＰＣＲ扩增结果（１．５％琼脂糖凝胶电泳）Ｆｉｇ．４．ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔａｉｌＤＮＡｏｆａｗｉｌｄｔｙｐｅ（１ａｎｅ２，３）ａｎｄａｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ（１ａｎｅ４，５）ｍｏｕｓｅｕｓｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓＳｌａｎｄＳ２（１ａｎｅ２，５）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａ４６８ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅａｌｌｅｌｅ，ａｎｄｐｒｉｍｅｒｓＭ２ａｎｄＮ２（１ａｎｅ３，４）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａ８００ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｇｅｎｅｋｏｎｃｋｏｕｔａｌｌｅｌｅＬａｎｅＩｃｏｎｔａｉｎｓａｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ图５ＫＯ和ｗＴ型小鼠脑ＦＭＲｌ基因ｍＲＮＡＲＴ－ＰＣＲ扩增结果（聚丙烯酰胺凝胶电泳）Ｆｉｇ．５．ＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｗｉｌｄｔｙｐｅ（１ａｎｅ２，３，４）ａｎｄｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ（１ａｎｅ５，６，７）ｍｏｕｓｅｕｓｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓＳ１ａｎｄＳ２（１ａｎｅ２，３，７）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａ１２０ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅａｌｌｅｌｅ，ａｎｄｐｒｉｍｅｒｓＳ１ａｎｄＮ２（１ａｎｅ４，５，６）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａ１１０ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｇｅｎｅｋｏｎｃｋｏｌｉｔａｌｌｅｌｅ．Ｌａｎｅ１ｃｏｎｔａｉｎｓａｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ．１．２实验动物ＦＭＲＰ蛋白表达的检测Ｋ０；ＮＷＴ型小鼠脑组织ＦＭＲＰ蛋白检测的结果如图６所示。

ｗ，ｒ型小鼠可以出现约为７２ｋＤａ的特异性条带，而Ｋ０型小鼠没有。

说明ＷＴ小鼠表达了ＦｌｄＲｌ基因的产物ＦＭＲＰ，１９ＦＭＲｌ基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究而Ｋ０小鼠ＦＭＲＰ缺如。

图６免疫印迹检测Ｋ０和ｗＴ型小鼠脑组织ＦＭＲＰ的表达Ｆ培．６．ｍＩｍｕｎｏｂｌｏｔ龇ａｌｙｓｉｓｏｆＦＭＲＰｉＩｌｃｏｎｉｃａｌｔｉｓｓｕｅｓｄｅｒｉｖｅｄ的ｍａｗｉｌｄｔｙｐｅｍｏｕｓｅ（Ｉ∞ｅ１），ａｈｅｔｅｒｏｚｙ９０ｕｓｆ啪ａｋ（１∞ｅ３），ａｍｕｔ∞ｔｍａｌｅ（１粕ｅ２），衄ｄａｍｕｔａＩｌｔｆｂｍａｌｅ（１ａｎｅ４），ｓｈｏｗｉｎｇｐｍｔｅｉｎｂ蛆ｄｓ曲＿０ｕｔ７２ｋＤａｏｎｌｙｐｒｅｓｅｎｔ证ｗｉｌｄｔｙ］ｐｅｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｌｏｔｗａｓｒ印ｒｏｂｅｄｗｉｍ卸ｔｉｌ，ｏｄｉｅｓａｇａｉ邶ｔａｃｔｉｎａｓｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌｓ．２．小鼠胡须行为观察实验在实验中我们观察到，小鼠在跨越至选择平台前首先会感知选择平台前端的鉴别物体表面，在两个平台间距离不大的情况卜－，小鼠可以通过胡须，鼻子，前肢去感知鉴别物体的表面，当两个平台间距离足够大时，小鼠只能通过其鼻子周围的胡须去触碰鉴别物体表面进行选择。

小鼠胡须行为观察实验结果见图７所示，小鼠胡须物体表面鉴别实验示在不同的平台间距离ＫＯ型小鼠和ｗＴ型小鼠表现出明显的差异（Ｐ＜Ｏ川）。

在选择平台与开始平台相接时，ＫＯ型小鼠达标行为所需的平均天数较ｗＴ型小鼠要明显延长（Ｐ＜Ｏ．０１）。

此后开始平台逐渐远离选择平台，在开始平台与选择平台间距离２ｃｍ、４ｃｍ时ｗＴ型小鼠获得达标行为所需的天数逐渐减少，而在ＫＯ型小鼠获得达标行为所需的天数也逐渐减少（Ｐ＜Ｏ．０１）。

在平台间距离６ｃｍ时，小鼠在开始平台的边缘只能用胡须触及选择平台前端的鉴别物体表面，ｗＴ型小鼠仍然只用了较少的天数达标，而在Ｋ０型小鼠达标天数明显增加（Ｐ＜０．叭）。

图７小鼠物体表面辨别实验ＦＭＲＩ基困敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究染色法，观察到ＦＭＲｌ基因敲除小鼠培养海马神经元树突棘长度增加，而密度无改变。

与神经元树突棘形态研究结果各有不同相似，对ＦＭＲｌ基因敲除小鼠神经元树突的研究也报道不一。

在神经元树突的研究中发现，ＦＭＲＰ在神经元树突的修剪及成熟方面起有重要的作用。

Ｇａｌｖｅｚ等对ＦＶＢ和ｃ５７Ｂ／６两个种系成年脆性ｘ综合征模型小鼠的胡须皮质感觉管状区的多棘星状神经元树突分支情况进行研究时发现，管状数量及大体模式与野生对照组小鼠相比无明显的差异，Ｂａｒｒｅｌｃｏｒｔｅｘ区域中心方向生长的树突分枝和对照组没有差异性，但周边方向生长的树突分枝则显著多于对照组。

“。

Ｉｒｗｉｎ对成年ＦＶＢ种系的脆性ｘ综合征小鼠模型视皮质第Ｖ层锥体神经元的树突直径、分枝趋势及分枝数进行研究发现和对照组并没有明显差异“”。

ＲｅｓｔｉｖｏＬ等对成年Ｃ５７Ｂ／６种系的脆性ｘ综合征模型小鼠视皮质第Ｖ层锥体神经元的长度及分枝数进行研究，发现其平均树突分支数减少，基底部树突棘的平均长度减少“…。

体外研究中Ｂｒａｕｎ和ｓｅｇａｌ应用ＦＶＢｌ２９种系的新生脆性Ｘ综合征模型小鼠对分散培养的海马神经元进行免疫荧光染色，发现培养７天、２ｌ天的神经元树突长度均较对照组为短，而胞体大小则无明显差异“…。

在本实验中，通过在体研究Ｇｏｌｇｉ染色，我们观察到无刺激组ＫＯ型小鼠Ｂａｒｒｅｌｃｏｒｔｅｘ区域中多棘星状神经元树突棘的长度较ｗＴ型小鼠增长，形态分类中ＫＯ组小鼠神经元树突棘幼稚细长形态的树突棘比例较ｗＴ组增加，但在树突棘ＦＭＲＩ基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究图１１胡须刺激后小鼠Ｂａｒｒｅｌｃｏｒｔｅｘ区中心方向上的树突与同心圆交点数的改变Ｆｉｇ．１１．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｗｈｉｓｋｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｂｒａｎｅｈｓｗｈｉｃｈｔｏｗａｒｄｓｔｌｌｅｂａｒｒｅｌｈｏｌｌｏｗｉｎＦＭＲ一，－ａｎｄＦＭＲ竹ｍｉｃｅ（ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｒｉｎｇｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｓｆｏｒｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＷＴａｎｄＫｏｍｉｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｕｎｔｏｕｃｈｍｉｃｅ）．ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｒｉｎｇｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｓｊｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｂｏｔｈＦＭＲ－／．ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｍｉｃｅ（ＫＯｓ）ａｎｄＦＭＲ＋／＋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｍｉｃｅ（ＷＴｓ）ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｕｎｔｏｕｃｈｅｄｍｉｃｅａｔ２０Ｂｉｎａｎｄ４０Ｉｎｎｒ＋ＷＴｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏⅥｃＰ＜０．０１．‘ＫＯｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＫＯｃＰ＜０．０１）．Ｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｒｉｎｇｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｓａｔｏｔｈｅｒｄｉｓｔａｎｃｅｓ（ＷＴｃｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＫＯｃＰ＞０．０５．ＷＴｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＫＯｓＰ＞０．０５）．图ｌ２胡须刺激后小鼠Ｂａｒｒｅｌｃｏｒｔｅｘ区周边方向上的树突与同一。