土壤微生物分析方法

土壤微生物分析方法
周丽霞
1. 土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸提取法）
Jenkinson and Powlson（1976）比较了γ-射线、高压灭菌、干热灭菌、氯仿熏蒸灭菌的效果，发现氯仿熏蒸灭菌处理可杀死99％以上的土壤微生物，并且未改变土壤的理化性质，且容易从土壤中除去。

因此，现在多利用氯仿熏蒸法进行土壤微生物生物量的测定。

（1）原理：土壤经氯仿熏蒸处理后土壤中的微生物被杀死，造成细胞破裂，使细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取的碳增加。

用盐溶液提取出由死后的微生物体内渗透出来的有机碳，通过测定浸提液中的碳含量，可以计算土壤微生物量碳。

（2）操作步骤：
①预处理：一般不需要。

如果担心土壤状况可能会影响分析结果（如土壤太
干，土壤中微生物生长不好等），可以将采集到的土壤调节其含水量达到最大持水量的60％，在25℃预培养1周。

②氯仿熏蒸处理（在通风橱内进行）：
在低温下保存的土壤要先从冰箱中取出，待放置到室温时再进行分析。

称取20 g过2mm筛的新鲜土样置于50 ml 小烧杯中，放入真空干燥器内，并在真空干燥器内放置一装有去乙醇氯仿的小烧杯，烧杯内可放置几片防爆沸的干净小瓷片。

同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液以吸收熏蒸期间释放出来的
CO2，还应放一装水的小烧杯（或在干燥器底部放一层湿滤纸）以保持湿度。

用少量凡士林密封干燥器，在真空泵与干燥器之间可以加一缓冲瓶以防止氯仿爆沸或由于抽真空使干燥器内外压力变化而造成干燥器破裂等现象发生，然后用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾。

关闭真空干燥器阀门，在25℃下暗处放置24小时。

熏蒸完成后，打开干燥器阀门（此时应听到空气进入的声音，否则可能熏蒸不彻底，要重新熏蒸），取出装水的小烧杯（或湿润的滤纸）、装有碱液和氯仿的烧杯（氯仿可倒回瓶中重复使用），用真空泵反复抽真空，并打开干燥器以除去土壤中残存的氯仿（止闻不到土壤中的氯仿气味）。

另称取等量土壤样品放入另一干燥器中，但不熏蒸，作为对照土壤。

③K2SO4浸提：
熏蒸结束后，将土壤转移到100 ml振荡瓶中，加入60ml （或土水比1:4）0.5 M K2SO4溶液，中速振荡60分钟以使土壤完全振荡开，静置后用中速定量滤纸过滤。

对照样品除不经氯仿熏蒸处理外，其他操作同熏蒸处理。

④测定分析：一般采用K2Cr2O7容量法或碳分析仪（TOC）测定法。

K2Cr2O7容量法：
吸取10ml上述土壤浸提液于150ml消化管中，准确加入10ml 0.018 mol L-1 K2Cr2O7-12 mol L-1 H2SO4溶液，再加入2～3片干净小瓷片（防爆沸），混匀后在175℃煮沸10分钟，冷却后转移至150ml三角瓶中，用去离子水洗涤3～4次消化管使溶液体积约为70～80ml，加入1滴邻啡罗啉指示剂，用0.05 mol L-1 FeSO4标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝绿色，再变为棕红色即为滴定终点。

TOC法：用TOC总有机碳分析仪测定土壤浸提液中的有机碳含量。

（3）结果计算：
K2Cr2O7容量法：
式中M 为FeSO4溶液浓度(mol L-1)，V0、V分别为空白和样品消耗的FeSO4溶液体积（ml），f为稀释倍数，12为碳毫摩尔质量（g），103为换算系数。

TOC法：
C mic(mg kg-1)=（熏蒸与对照TOC差值×稀释倍数）/（k Ec×土壤干重）
k Ec为将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的系数(转换系数), 目前采用的k Ec值是根据FI 方法间接获得。

一般量容法采用的k Ec值为0.38, 仪器分析法k Ec取值0.45 (在极酸性土壤中k Ec 偏低，要根据土壤情况选择适当的k Ec ) 。

（4）注意事项：
①实验结果以土壤干重来表示，计算时一定要考虑土壤含水量；
②如果数据结果变异较大时，要认真分析可能的原因，如：
a 是由于样点的异质性造成的还是操作过程造成的？
b 操作过程中土样采集与处理过程是否一致（土样是否混匀，土中杂质，
尤其是根与植物残体是否清除干净等）？
c 熏蒸、浸提是否同批进行？浸提液是否立即进行分析？
（5）方法特点：
优点：氯仿熏蒸提取法测定土壤微生物生物量碳总量快速、简便，适合大量样品分析。

不足之处：无法确定土壤中不同菌类的数量与比例。

2. 土壤微生物区系组成（平板法）
（1）原理：在自然条件下，土壤中大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。

根据在特殊培养基上生长并形成的微生物菌落数量，可以估算土壤微生物的数量。

（2）操作步骤：必须在超净工作台或无菌工作间进行
①培养基配制。

根据需要测定的微生物种类（如细菌用牛肉膏蛋白胨培养基,真菌用马丁氏培养基,放线菌用高斯一号培养基等），按配方配制好培养基并在121℃灭菌20分钟。

待培养基冷却至45-50℃左右时分装入灭菌后的培养皿内。

②接种培养。

取新鲜土样10克，放入装有90ml无菌水的广口瓶中振荡混匀，此为10-1土壤稀释液。

迅速用灭菌移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入装有90ml无菌水的广口瓶中振荡混匀，此为10-2土壤稀释液。

依次配置10-3、10-4、10-5、10-6土壤稀释液。

取3个稀释倍数的土壤稀释液（根据微生物在土中的数量多少选择），吸取0.1ml分别放入已注入培养基的培养皿中（每变换一次稀释液，应更
换一次吸管），并立即用灭菌玻璃刮刀将土壤稀释液均匀涂抹于琼脂表面。

每个稀释倍数至少应有3个重复。

然后将培养皿倒置于28℃培养箱中培养一定时间（一般细菌2-3天、真菌3-5天、放线菌7-14天）后统计菌落数。

（3）结果计算：
土壤微生物数量（菌落数/克干土）＝平均菌落数×稀释倍数/土壤干重（4）注意事项：
①培养基现配现用,防止因污染、脱水等影响而变质；
②需临时储存的培养基，应放在低温、避光、清洁的地方；
③接种用的器械如吸管、接种针等要先灭好菌，并制备无菌水。

（5）方法特点：
优点：操作简便，最适合于菌体大小差不多的类群。

可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量，特别是具有特殊功能的微生物类群，如氨化细菌、硝化细菌、固氮菌等。

不足之处：测定结果的精确度和重复性较差，在培养基上形成的菌落可能来自多个细胞，或多个菌成群聚集在一起。

而且大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长，所测得的微生物数量通常不到土壤中微生物实际数量的1％，故不能作为土壤微生物的真实数量。