(仅供参考)液相及液质分析方法学的开发及验证
液质联用分析实验报告
液质联用分析实验报告一、实验目的本实验旨在通过液质联用分析方法，研究食品中的有害物质及其含量，为食品安全问题提供科学依据。
二、实验原理液质联用分析是将液相色谱（LC）和质谱（MS）的优点结合在一起，通过色谱分离和质谱分析技术，对样品中的化合物进行快速准确的识别和定量。
LC与MS的耦合使得LC在分离过程中能够直接将分离的化合物送入MS进行分析，并能够快速准确地进行质量分析。
三、实验步骤1.样品处理：将食品样品进行研磨和溶解，制备成适合LC-MS分析的样品溶液。
2.色谱条件设置：设置LC柱、流动相、流速、梯度洗脱等参数。
3.MS条件设置：设置电离模式、扫描范围、碎裂能量等参数。
4.样品注射和分析：将样品溶液注入LC-MS系统进行分析。
5.数据处理：根据分析结果，计算样品中有害物质的含量，并生成相应的图表和报告。
四、实验结果与讨论通过分析的样品，我们检测到其中一种有害物质A的含量为10mg/kg，超过了食品安全标准的限制。
进一步分析发现，在样品中还存在其他有害物质B和C，但其含量均在安全范围内。
通过液质联用分析技术，我们能够快速准确地对食品样品中的有害物质进行分析和定量。
这为我们提供了一种重要的工具，用于食品安全问题的研究和监测。
五、实验总结本实验通过液质联用分析方法，对食品样品中的有害物质进行了检测和定量分析。
实验结果显示，样品中存在一种有害物质的含量超过了安全标准，提示食品的安全性存在问题。
通过本实验的实施，我们深入了解了液质联用分析的原理和方法，并掌握了其在食品安全研究中的应用。
实验结果对于我们加强食品安全管理具有重要意义，为进一步解决食品安全问题提供了科学依据。
液相、液质检测技术原理及应用
2. 进样系统：
六通阀为常用的进样方式 作用：将分析样品定量的输 送入高压色谱系统内。 要求：重复性好、死体积小 ，便于实现自动化。
3.分离系统:
组成：色谱柱和柱温箱 填料组成：C18、C8、CN-、NH2-、阳离子交换、阴离子交换 等
正相：极性色谱柱-非极性流动相 反相：非极性色谱柱-极性流动相 柱填料：2µm、3µm、5µm 柱规格：2.1×150mm、 2.1×100mm、4.6×150mm、 4.6×250mm、3.5×150mm等
液相检测技术原理及应用
所级公共技术中心 王莹
第一章 液相色谱仪的结构和原理
液相色谱仪（5大系统组成）
输液 系统
进样 系统
分离 系统
检测 系统
高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
记录系统
1、输液系统:
（1）贮液系统（离线脱气、在线真空脱气） （2）高压泵：将流动相在高压下连续输送入色谱柱，使样品 在色谱柱内完成分离过程。 （3）输液系统的辅助设备：管道过滤器（在线过滤器）、脉 动阻尼器、压力传感器、显示装置、流动相流量测定装置等 。 （4）梯度洗脱：提高分离效果
液质联用(LC-MS) ：不挥发性化合物分析测定； 极性化合物的分析测定； 热不稳定化合物的分析测定； 大分子量化合物的分析测定； 无商品化的谱库，只能自己建库或 自己解析谱图。
现有仪器及配置
Varian LC Thermo UHPLC Waters LC-MS Thermo LC-MS-MS
UV、FLD PDA 、FLD PDA，单级四级杆、配有ESI、APCI电离源。 PDA ，串联三重四级杆、配有ESI、APCI电离源。
只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
《液相色谱方法开发》课件
检测器的选择：选择合适的 检测器，如紫外、荧光等
样品的处理：对样品进行适 当的处理，如稀释、过滤等
检测灵敏度的优化
提高检测灵敏度的方法：增加样 品浓度、延长检测时间、提高检 测温度等
检测灵敏度的评估：使用标准样 品进行检测，计算检测限、定量 限等指标
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
优化检测条件的选择：选择合适 的流动相、色谱柱、检测器等
重复性验证的目的：确保方法的稳定性和可靠性 重复性验证的方法：多次重复实验，比较实验结果 重复性验证的标准：实验结果的差异应在可接受范围内 重复性验证的注意事项：确保实验条件一致，避免实验误差
方法的线性范围验证
线性范围：指样品浓度与检测 信号之间的线性关系
验证目的：确保方法在特定浓 度范围内具有线性关系
液相色谱法的应用
分析化学： 用于分析 有机化合 物、无机 化合物、 生物大分 子等
药物分析： 用于药物 成分分析、 药物代谢 研究等
环境监测： 用于水质、 大气、土 壤等环境 样品的分 析
食品分析： 用于食品 添加剂、 农药残留、 微生物等 分析
生物技术： 用于蛋白 质、核酸、 多肽等生 物大分子 的分析
如二硫苏糖醇、尿素等
氢氧化钠等
核酸样品：使用核酸酶和变性剂处理， 如RNase A、SDS等
药物样品：使用酸和碱处理，如乙酸、 氢氧化钠等
脂质样品：使用有机溶剂和表面活性剂 处理，如乙腈、Triton X -100等
环境样品：使用固相萃取和液液萃取 处理，如C18、乙酸乙酯等
实际应用案例解析
案例一：药 物分析
案例三：食 品检测
案例二：环 境监测
案例四：生 物样品分析
液相及液质分析方法学的开发及验证
液相及液质分析方法学的开发及验证液相及液质分析方法学的开发及验证是化学分析领域中非常重要的研究内容。
液相分析方法学主要研究如何选择适当的试剂、溶剂、分析柱等条件，使样品溶解、分离、测定和定量变得更加准确、灵敏和可靠。
液质分析方法学则是在液相分析方法学的基础上，通过耦联质谱等仪器进行检测和分析，可以获得更高灵敏度和更好的特异性。
液相及液质分析方法学的开发和验证通常需要以下的步骤和方法。
首先，基于需求和目标，确定研究对象和分析目标。
确定所需分析的化合物或成分，并有清晰的分析目标，比如检测限、灵敏度、准确度等，以指导后续研究。
其次，选择合适的试剂和溶剂。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的试剂和溶剂，以提高分析的准确性和灵敏度。
试剂应具有高纯度和稳定性，以确保试剂本身不会引入干扰物质。
溶剂的选择要考虑溶解能力、流动性以及对仪器的兼容性。
然后，进行样品制备和前处理。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的样品前处理方法，如液液萃取、固相萃取等，以提高分析样品的纯度和准确性。
样品前处理的步骤要具有高效性、选择性和稳定性，以确保获得准确的分析结果。
接下来，选择合适的分析仪器和方法。
根据分析目标和样品性质，选择适合的分析仪器和方法，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱等。
根据仪器的参数和分析方法的要求，进行合理的调整和优化，以获得最佳的分析条件。
在开发出一套满足分析要求的方法后，需要进行验证。
验证的目的是评估方法的可靠性和适用性。
验证通常包括准确度、精密度、选择性、线性范围、检测限等方面的评估。
通过在不同条件下进行重复性试验，并进行统计分析，评估方法的精准性和可重复性。
同时，通过对样品添加不同浓度的目标物质或干扰物质进行检测，评估方法的选择性和准确度。
此外，还需要进行方法的稳定性和恢复率等评估。
最后，将开发和验证的方法应用于实际样品的分析。
根据实际的需求和样品的性质，进行实际样品的分析。
在实际分析中，要注意方法的适应性和准确性，并进行合理的质量控制措施，以确保获得可靠、准确的分析结果。
液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发液相色谱的方法...
离子交换树脂的交换容量
液相色谱柱及分离机理的关系
❀ 从色谱方法上分
✎ 正相 / 反相 ✎ 离子交换 ✎ 分子体积排除 ✎ 亲合 ✎ 疏水回受
❀ 从柱子类型上分
✎ 分配 / 吸附 ✎ 离子交换 ✎ 凝胶 ✎ 亲合
色谱柱化学及外形结构的关系
液相色谱柱
填料
柱管
颗粒表面性质
颗粒度
长度
内径
材料
化学性质 k α 分辨率
对HPLC柱的了解 二
❀ 平均孔径/孔体积 ❀ 孔径/孔体积分布
✎ 大的孔径可分析高分 子量的分子
对HPLC柱的了解 三
❀ 键合相化学
✎ 影响化合物的分离度 α ✎ 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 ✎ 可能导致色谱的分离机理不同 ✎ 如 C18 C8 CN
对HPLC柱的了解 四
❀ 含碳量
机械因素 N
寿命 柱效 速度 溶剂消耗
对HPLC柱的了解
❀ 平均颗粒度 颗粒度分布
✎ 颗粒度(dp)
➠ 颗粒度越小 柱效越高(传质好 涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差)
✎ 颗粒分布
➠ 颗粒分布越宽 柱效低(渗透性差)
✎ 颗粒形状
➠ 球型 柱效高 重现性好 柱床结构均匀 ➠ 无定型 柱床结构不均匀
流动相线性速度不均匀 谱带扩展
Symmetry C8
12
Resolve C-18
12
Ultrasphere ODS 11
Partisil ODS-3
11
µBondpak C-18 10
Nova-Pak C-18
7
k‘苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
分析方法开发与验证
分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。
一、分析方法开发分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。
目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。
1.色谱柱的选择原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um 填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。
我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。
一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。
对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。
三种类型包括：1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。
一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。
了解液分析如何正确进行液检查
了解液分析如何正确进行液检查液分析是一种重要的化学分析方法，广泛应用于许多领域，包括环境监测、食品安全、药物研发和工业生产等。
正确进行液检查是保证结果准确性和可靠性的关键。
本文将介绍液分析的基本原理、常用的液检测方法以及正确进行液检查的步骤和注意事项。
一、液分析的基本原理液分析是通过使用化学反应和物理性质测定样品中某种化学物质的含量。
液分析的基本原理是根据样品中所含化学物质的特性，选择适当的分析方法进行测定。
液分析的常用原理包括酸碱滴定、电化学分析、光度法、荧光法、质谱法等。
根据需要，可以选择单一的原理或者结合多种原理进行液分析。
二、常用的液检测方法1. 酸碱滴定法：酸碱滴定法是通过滴定剂与待测物质发生化学反应，根据反应中生成或消耗的中间物质的化学计量关系来测定待测物质的含量。
这种方法通常用于酸碱度的测定，如pH值测定。
2. 电化学分析法：电化学分析法是通过利用电化学原理测定溶液中某种物质的含量。
常见的电化学分析方法包括电位滴定法、极谱法、电导法等。
这些方法适用于测定金属离子、有机物、无机酸等。
3. 光度法：光度法是通过测量溶液中化学物质对光的吸收或散射来确定其浓度。
常用的光度法包括紫外可见分光光度法、比色法和荧光法等。
这些方法适用于测定有机物、无机物、重金属等。
4. 质谱法：质谱法是通过对样品中化学物质的碎片进行质量分析来测定其含量。
质谱法常用于分析有机化合物、有害物质和药物等。
三、正确进行液检查的步骤和注意事项1. 样品处理：首先，应根据液检测的目的选择适当的样品处理方式。
常见的样品处理方式包括提取、浓缩、过滤、稀释等。
2. 选择适当的分析方法：根据样品的特性和检测的目的，选择适当的液分析方法。
在选择分析方法时，要考虑分析的灵敏度、准确性、重复性和操作的简便性。
3. 样品制备：根据选定的液分析方法，按照要求制备样品。
这包括溶解、调整样品的pH值、去除干扰物质等。
4. 校准和质控：在进行液检查前，应进行校准和质控实验，以保证仪器的准确性和结果的可靠性。
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2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
Impact on Resolution
% Improvement
Double N
20 – 40%
Double k
15 – 20%
16
Double α
> 400%
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
7
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD ≤ 1%, n ≥ 5 • 分离度
– Rs ≥ 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
O-Si
O-Si OH O-Si O-Si OH
O-Si OH O-Si O-Si O-Si
OH O-Si O-Si
双重保留机理:
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
13
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
H+N(CH3)2
O-Si
O-Si
O-
离子交换作用
O-Si
O-Si
O- (CH) H+N OO-S- i 3 2
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
IA
Fl
D
O
P
Fe
Fl I AO
Fl O
D
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
33
PD Fe
浓度2:80% 原料及制剂
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
固定相
传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性 化合物峰形的影响
流动相 pH 7
Propranolol and Butylparaben Naphthalene
Acenaphthene
铝杂质含量 ~375 ppm Tf USP = 6.5
Amitriptyline
5
15
25
35
45
Minutes
24
固定相
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
31
流动相pH值
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大
40
中性化合物的保留不受pH影响
35
30 酸性
中性化合物
Retention Factor (k)
25
20 酸性保留增强 [HA]
15
碱性保留增强 [B]
10
5 碱性
0
0
2
4
6
8
10
12
pH
Silica pH Range
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
11
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
12
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
• 拖尾因子
– T≤2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
8
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
9
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
6. Imipramine (B)
7. Amitriptyline (B)
8. Flavone (N)
9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB)
10. Diclofenac (W来自)11. Dioseb (A)
12. Octanophenone (N)
30
34
10 11
Hybrid Particle pH Range
32
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18
pH 10, ACN
PD
Fe
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
α −1 k α k +1
Chemical
Maximized in UPLC Separations by:
Range of column chemistries Multiple particle substrates Wide usable pH range High retentivity Wide range in selectivity
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
15
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs = N
Physical
4
Maximized in UPLC Separations by:
Ultra-low dispersion system Small [< 2 µm] particles Higher pressure capability Well-designed columns
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
6
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
21
固定相
端基封口基团 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
22
键合相(配体)：C18 残留硅羟基
硅胶基质
固定相
CSH C18
Fl
I A
D
O
P
Fe
CSH Phenyl-Hexyl I A
Fl
D
O
Fe
P
CSH Fluoro-Phenyl
IA
Fl DO
Fe
P
HSS C18 SB
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18
pH 10, ACN
PD
Fe
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
阿密曲替林
6.00 7.00 8.00
26
固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿 润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的 保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔 内！
27
固定相
HPLC及HPLC/MS分析方法的开发 及其在药物分析中的应用
李晓东 中国食品药品检定研究院 北京 100050
E-mail: xdli@
HPLC及HPLC/MS法