生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展
甲烷制备合成气工艺开发进展 (1)
该反应可在较低温度（７５０—８００℃）下达到 ９０％以上的热力学平衡转化，反应接触时间短 （＜１０。２ ｓ），可避免高温非催化部分氧化法伴生 的燃烧反应，ＣＯ和Ｈ２的选择性高达９５％，生成 合成气的Ｈ２／ＣＯ比接近２，适合于合成甲醇、费托 合成等后续工业过程。与传统的蒸汽转化法和联 合重整法相比，甲烷催化部分氧化制合成气的反 应器体积小、效率高、能耗低，可显著降低设备投 资和生产成本。因此，此工艺受到国内外的广泛 重视，研究工作十分活跃。自９０年代以来，人们 针对甲烷催化部分氧化反应所采用的氧化剂、原 料配比、催化剂体系、工艺条件及反应器的不同已 开发出固定床【３，４｜、流化床［５，６３以及陶瓷膜工艺 等【７１ ９３。对这些工艺进行开发的国外公司主要有
石油资源作为２０世纪的主要能源在石油、化 工领域占据了重要的地位。但由于长期大量开 采，储量日趋匮乏，使世界能源结构正在发生深刻 变化。据专家预测，到２ｌ世纪中叶，天然气在世 界能源结构中所占比例将由目前的２５％上升到 ４０％左右，而石油将从目前的３４％降至２０％…。 因此，天然气作为一种高效、优质、清洁的能源和 化工原料，将逐步取代石油而占主导地位，成为 ２１世纪的主要能源，而研究和开发利用天然气的 新技术、新工艺也就成为人们关注的焦点。 天然气的主要成分是甲烷。利用甲烷制备化 工产品主要有两条途径：直接转化法，如甲烷直接 氧化偶联制乙烯，甲烷选择氧化制甲醇、甲醛等； 间接转化法，即经合成气生产合成氨、甲醇和烃类 等，如利用合成气（ＣＯ＋Ｈ２）作为中间产物，在Ｃｕ／ ＺｎＯ催化剂上合成甲醇（ＣＯ＋２Ｈ２一ｃｎ３０８）或通 过费托过程在Ｆｅ和ｃｕ催化剂上合成烃类［ｎＣＯ ＋２ｎＨ２一（ＣＨ２）ｎ］。 由于直接转化法中目的产物在苛刻的反应条 件下很容易深度氧化为Ｃ０２和Ｈ２０，存在转化率 低、产率低、选择性较差等缺点，近期内工业化较 困难。而采用先将天然气转化为合成气，再合成 化学品和燃料的间接转化法目前已在工业上广泛 应用，而且随着以合成气为原料的许多化工合成 过程中一些新技术的不断诞生，将会使间接转化 法在天然气综合利用中发挥更大的作用。为此， 笔者将国内外已工业化应用的天然气转化为合成 气工艺技术的改进及新技术的研究开发进展综述 如下。
产甲烷菌的研究进展
产甲烷菌的研究进展XXX生物工程一班生命科学学院xxx大学150080摘要：甲烷菌是一个古老的原生菌。
随亨格特（Hungate）无氧分离技术发展以来，人们对甲烷菌的研究逐渐深入。
从产甲烷菌生存环境分离、筛选出新的产甲烷菌种。
20世纪90年代对甲烷菌的探讨、研究比较多，近10年的研究比较少。
简述了产甲烷菌的发展历史及分类。
产甲烷菌是重要的环境微生物,是古细菌的一种，在自然界的破素循环中起重要作用。
迄今已有种产甲烷菌基因组测序完成。
基因组信息使人们对产甲烷菌的细胞结构、进化、代谢及环境适应性有了更深的理解。
关键词：微生物，产甲烷菌，分类。
Research progress of methanogenic bacteriaZhengzongqiaoThe first class of Biotechnology, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin,150080Abstract: methanogens is an ancient native bacteria. With the Since Heng Gete (Hungate) anaerobic separation technology development, people gradually in-depth study of methanogens. Living environment separated from the methane-producing bacteria filter out new methane-producing bacteria. Of methanogens in the 1990s, research more, nearly 10 years of study is relatively small. The brief history of the development of the methanogenic bacteria and classification. Methane-producing bacteria is an important environmental microorganisms, is a kind of archaebacteria, play an important role in the hormone cycle of the nature of the broken. So far has been a kind of methane-producing bacteria genome sequencing is completed. Genomic information to make The Methanogens the cell structure, evolution, have a deeper understanding of metabolic and environmental adaptability.Keywords: microorganisms, methane-producing bacteria。
微生物厌氧甲烷氧化反硝化研究进展_袁梦冬
近年来，由于工业和农业废水的超标排放，我国 地表水体氮素含量不断升高，水体富营养化事件频 频发生，严重威胁人畜饮用水安全。厌氧和好氧处 理相结合的工艺是目前我国工业和农业废水处理常 用的技术。然而此类技术的应用，尤其是在中小型 废水处理厂，往往导致厌氧段温室气体甲烷［1 － 2］难 以有效资源化利用而大量无序排放、好氧段处理出 水 C / N 低、反硝化深度脱氮处理碳源不足、出水难 以达标等一系列环境与经济问题。
5CH4 + 8NO3 － + 8H + → 5CO2 + 4N2 + 14H2 O ΔGθ， = － 765 KJmol －1 CH4 公式（ 1）
3CH4 + 8NO2 － + 8H + → 3CO2 + 4N2 + 10H2 O ΔGθ， = － 928 KJmol －1 CH4 公式（ 2）
Mengdong Yuan et al． / Acta Microbiologica Sinica（ 2014） 54（ 2）
厌氧甲烷氧化机理［3，7］，2010 年由 Ettwig 提出。 1. 1 逆向产甲烷耦合反硝化途径
逆向产甲烷途径（ Ｒeverse methanogenesis） ［8 － 11］ 是最早提出的厌氧甲烷氧化发生过程的假说，由厌 氧甲烷氧化古菌完成。由于产甲烷过程所涉及的大 部分酶促反应均可逆，该理论依据提示存在逆向产 甲烷的途径。Zehnder 等［12］通过同位素试验发现， 厌氧条件下产甲烷菌可在产甲烷的同时氧化少量的 甲烷并生成甲醇、甲酸和 CO2 等中间产物。Hallam 等［1l Ｒiver） ，从分子生物 学角度证实了厌氧甲烷氧化古菌中含有除编码亚甲 基-H4 MPT 还原酶的功能基因之外的所有产甲烷基 因，并提出了相关逆向产甲烷理论的模型： 该途径经 过甲烷活化，以及一系列脱氢酶的作用，最终被氧化 为 CO2 （ 图 1） ［14 － 15］。由于甲烷很稳定，该途径中以 甲烷 的 活 化 过 程 最 难 发 生，甲 基 辅 酶 M 还 原 酶 （ methyl-coenzyme M reductase，MCＲ） 在该途径中起 到活化甲烷的作用，编码 MCＲ 的 mcrA 基因以及检
烷烃单加氧酶基因的体外酶活测定
烷烃单加氧酶基因的体外酶活测定(1)底物处理:取50 mmol/L Tris-HCl 100mL,加入1 mg表面活性剂PlysurfA-210G,混匀,再加入100 umol烷烃(十五烷或其它烷烃),ICKTC煮沸5niin后,立刻使用UP200sUltraschalIprozessor 在100%Amplitude 强度下,持续超声1min,使烷烃均匀分散,准确量取3mL烷烃混合物于的螺口旋盖管中,冷却至可以使用。
(2)酶活反应:加底物至终浓度为0.5 mM,辅酶(NADH或NADPH)终浓度为1mM,适量经纯化的蛋白,其余体积由50 mmol/L Tris-HCl补齐,一定温度下振荡反应一定时间。
反应结束后,加入等体积氯仿萃取后,直接使用ShimadzuUV-250 UV分光光度计在0D340条件下测定NADH残留量。
或者加入三十二烷为内参,再加入等体积的正己烷萃取后,无水Na2S04脱水,使用Agilent 6820气相色谱仪测定残留的烷烃量,色谱柱为SPBTM-5 capillary column (30mx0.53mm i.d.,1.5um thickness) (Supelco),色谱程序如下:进样口: 280 摄氏度柱温:150°C,5min ，15度/min 程序升温280°C, 30min检测器(FID)温度: 350。
C;载气(N2) : 35mL/min;空气: 400mL/min ;氢气(H2) ; 30mL/min;尾吹(N2) : 20mL/min。
一个酶活单位定义为每分钟内氧化1.0 umol底物(NADH)所需的酶蛋白量(mg)。
(3)底物范围:选用不同底物,包括正戊烷,正己烷,正辛烷,正癸烷,十二烷,十五烷,十六烷,十七烷,十八烷,二十四烷,二十八烷,硝甲烷,甲磺酸,苯,苯甲酸钠,甲苯,邻苯二酷,联苯,十四烷醇,十六烷醇,十八烷醇,进行相应反应,测定酶活。
甲烷氧化菌
工业常常被责为使地球变暖的“温室”气体 之源,但是农业也向大气中排放“温室”气体。
中文名称：
甲烷
英文名称：
methane;CH4
定义：
甲烷分子的结构图
一种主要由稻田和湿地释放出来的温室气体。 甲烷在自然界分布很广，是天然气、沼气、油田 气及煤矿坑道气的主要成分。它可用作燃料及制 造氢气、碳黑、一氧化碳、乙炔、氢氰酸及甲醛 等物质的原料。
2.标记性DNA序列区段的选取
高质量代表性DNA 获取后,选取具有标记性 DNA 序列区段对T—RFLP 分析尤其重要。 多年来的研究表明,对于细菌来说,16S rRNA 基因区段因其高度的保守性已经成为 备受青睐的系统发育分析生物标记;但由于 过度保守,使得某些微生物在种甚至属水平 上难以准确区分。
虽然大气中甲烷的含量仅为二氧化碳的1/ 27, 但每摩尔甲烷引起气候变化的作用是每 摩尔二氧化碳的20~30倍。因此, 减少甲烷 排放要比减少等量的二氧化碳排放, 对减少 温室效应的贡献要大的多。
甲烷是一种重要的温室气体, 近200 年来其 在大气中的含量以每年1%的速度急剧增加, 主要是由于甲烷排放源的增加和甲烷汇的 减少。80% ~ 90% 的甲烷来源于生物活动, 而甲烷的唯一生物汇为土壤里甲烷氧化细 菌的氧化作用, 大约占大气甲烷汇的10%。
甲烷氧化途径的第二个酶是甲醇脱氢酶 ( methanol dehy drog enase, MDH) 。所有 革兰氏阴性甲基氧化菌都有编码甲醇脱氢 酶大亚基的mxaF基因, 其序列高度保守, 因 此MDH 可以作为这些生物在环境中存在的 很好指示剂。 Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌在环境中的分布并 不相同:Ⅰ型甲烷氧化菌在允许氧化菌快速 生长的环境中占优势, 而Ⅱ型菌在贫营养环 境下能存活得更好，从而有较广泛的分布。
甲烷干重整研究进展
组装 和扩 大 规模 的新 型反应 器 ， 在低 额 定 功率 时 其 的反 应 物 转 化 率 比前 一 种 反 应 器 显 著 提 高 。Ａ Ｍ Ｇ ｏｂ ｎａ ｅ ｈｒａ ｚｄ ｈ等 研 究 得 出 ： 冲冷 等 离 子 体 可 促 脉 使分 子快 速 解离 达 到饱 和 ，激 发 分子 反 应 的进行 ，
的体 积 比 ， Ｈ 和 Ｃ ： Ｃ Ｏ 的转 化 率 随总 流 量 的增 大 而 减小 ， 原料 气 中加 入适 量 的 Ｈ 明显提 高 Ｃ Ｃ ： Ｈ和 Ｏ
的转 化率 和有 效 的抑 制积 炭 。ＷａｇＱ 等 对介 质 ｎ ｉ 固
阻挡 放 电 甲烷 干重 整 的研 究 发 现 ： 大 Ｃ 增 ０ 在原 料
甲烷 干 重 整 因具 有 如下 的优 点 而 受 到 越 来 越
多 的关 注 ：１ 甲烷 和 Ｃ （） Ｏ 原料 来 源广 泛 ， 全球 大 如 力 发 展 可再 生 的生 物 天然 气 （ 沼气 ） 约 ６ ％ 甲烷 含 ０
和 自热 重 整 等 。其 中 甲烷 湿 重 整 是 传 统 的 制 氢 方
第 ６期
赵
健等 ： 甲烷 干重 整研 究进展
５ ３
甲烷千重整研究进展
赵 健 ， 周 伟 ， 吉辉 ， 建 新 汪 马
（． １华东 理工 大学资 源 与环境 工程 学 院， 海 ２ ０ ３ ； 上 ０ ２７ ２同济大 学新 能源 汽 车工程 中心， ． 上海 ２ １ ０ ； ． 大学 汽车学 院， ０ ８ ４ ３同济 上海 ２ １０ ） ０ ８ ４
体 、 剂 、 备 方法 、 作 参数 、 应 机 理 及 积炭 等 方 面 开 展 的 研 究 工作 及 新 的等 离 子 体 干 重 整技 术 研 究 取 得 的 进 展 。 助 制 操 反 关键词 ： 甲烷 ； 重 整 ； 合 成 气 ； 究 进 展 ； 化 剂 ； 离 子 体 ； 干 制 研 催 料气 Ｃ ４ Ｃ ｚ 将 Ｈ 和 Ｏ 同时通 人放 电 区域 和等离 子 体射 流 区域 ， 大 提 高 了工艺 的处 大
甲烷厌氧氧化微生物的研究进展
甲烷厌氧氧化微生物的研究进展沈李东;胡宝兰;郑平【摘要】Methane is a major greenhouse gas, which contributes estimatedly 20％ to global warming. Microbially mediated anaerobic oxidation of methane (AOM) is an important way to reduce methane emission in nature. According to different coupling reactions, AOM can be divided into two types, Sulphate-dependent anaerobic methane oxidation( SAMO ) and Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation ( DAMO ). S024- and NO2-/NO3- function as their terminal electron acceptors, separately. This review summarizes types of AOM and microorganisms involved, elaborates mechanisms of the AOMs, and discusses orientation of the future research and prospects of the application of AOM.%甲烷是一种重要的温室气体,其对全球气候变暖的贡献率约占20%.微生物进行的甲烷厌氧氧化(Anaerobic oxidation of methane,AOM)是减少自然环境中该温室气体排放的重要生物途径.根据耦联反应的不同,可将AOM 分为两类,即硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(Sulphate-dependent anaerobic methane oxidation,SAMO)和反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation,DAMO),前者以SO2-4作为AOM 的最终电子受体,后者以NO2-/NO3-作为AOM的最终电子受体.深入了解这两种类型AOM的发生机理,有助于更好地理解该生物过程的重要性,为AOM工艺的开发提供理论依据.鉴此,本文简要介绍了不同类型的AOM及其参与的微生物,着重阐述了其发生机理,并探讨了AOM未来的研究方向与应用前景.【期刊名称】《土壤学报》【年(卷),期】2011(048)003【总页数】10页(P619-628)【关键词】硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(SAMO);反硝化型甲烷厌氧氧化(DAMO);机理【作者】沈李东;胡宝兰;郑平【作者单位】浙江大学环境工程系,杭州,310029;浙江大学环境工程系,杭州,310029;浙江大学环境工程系,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】X172甲烷作为一种重要的能源，在人类的生产生活中扮演着重要的角色。
甲烷氧化菌培养条件的优化(论文解析)
2.当据图分析C2、C5具有类似的生长过程，和崔俊儒等的研究有相 类似之处，其研究指出甲烷氧化菌利用甲烷生成甲醇在催化剂PDM 的作用下生成甲醛最后转化为二氧化碳。此过程于甲烷氧化菌利用 葡萄糖的途径有相吻合之处，所以在甲醇和葡萄糖的生长曲线下二
1.2000
1.0000
0.8000
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
PH=5 PH=6 PH=7 PH=8 PH=9
24H甲烷平均消耗量 24H细胞浓度平均值 48H甲烷平均消耗量 48H细胞浓度平均值 72H甲烷平均消耗量 72H细胞浓度平均值
不同PH条件下分 析
1.甲烷氧化菌的生长在PH5-7的时候生长状况良好，细胞的浓度于甲烷 的消耗量之比远远高于PH8-9。在培养中PH为6的时候甲烷氧化菌的生
者基本平行。
3.在以C3、C7为碳源的条件下甲烷氧化菌基本不生长，柠檬酸和甲 酸钠的存在对甲烷氧化菌或对其生长过程中的酶有着毒害作用，从 而不能生长。在以C4为碳源的过程中其生长过程有一个缓冲的过 程，在48H后甲烷氧化菌迅速生长其生长效果介于C1和C2之间，具
有相当可观的工业生产价值。
不同PH条件下甲烷氧化菌生长状况
材料与方法法
实验仪器与培养基 菌种的获取方法 不同条件实验操作和方法
1不同碳源培养试验研究 2不同pH培养条件下试验 3加入橡胶颗粒的实验 4加入EDTA的实验
结果与讨论
不同碳源对甲烷氧化菌生长的影响
1碳源浓度的确定 分析表可知当碳源在0.2g/L的时候甲烷氧化菌生长速度较
快，细胞浓度较高，在600nm的吸光值为0.301Abs。随着 葡萄糖浓度的不断升细胞浓度呈逐渐降低的趋势，其原因 是高其细胞外的物质浓度高于细胞内的浓度导致细胞内水 分的减少新陈代谢速度减慢从而生长状况降低。
基于适体和连续复制的生物传感器对凝血酶的检测
基于适体和连续复制的生物传感器对凝血酶的检测邹元明【摘要】In this study, CdS nanoparticles were prepared as electrochemical markers, and were labeled with the 5'end amino-modified aptamer DNA sequences using the condensation reaction to produce the CdS nanoparticle-labeled DNA probes with the electrochemical activity. The probes were immobilized on magnetic beads through DNA hybridization. In the polymerization system, a specific recognition of the thrombin aptamer will trigger polymerization, which replaces the tag CdS probe and releases it into the solution. In the polymerization and replacement, one thrombin molecule was repetitively employed as target, amplifying the signal to a great extent. The Anodic Stripping Vol-tammetric (ASV) interrogation of CdS different nucleotides were tested using this system to show the good selectivity of this system.%利用DNA适体对靶物质的识别,以及DNA聚合反应具有替换模板链上结合的靶目标的特点,设计了一个分子机器用于适体靶的检测.适体序列通过酰胺键连接CdS纳米颗粒,当溶液中出现待检测的凝血酶的时候,使引物互补部分暴露,在DNA聚合酶、dNTP(4种三磷酸脱氧核苷酸混合物)组成的聚合体系的作用下,引发一系列聚合反应,将大量附有凝血酶和CdS 纳米颗粒的适体序列替换下来释放到溶液中.溶液中的CdS纳米颗粒可以通过阳极溶出伏安法(ASV)测定.本研究通过这一方法探讨作为靶的凝血酶的存在和浓度与ASV响应的关系,从而建立这一检测方案的定量关系,并探讨这一检测方案对于其他类似物质的选择性.【期刊名称】《青岛科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】6页(P379-383,389)【关键词】凝血酶;适体;纳米颗粒;生物传感器【作者】邹元明【作者单位】青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】O652.7;Q527.1适体传感器［1－2］的研究十分活跃，其应用涉及蛋白质组学、病毒检测、疾病诊断和环境检测等方面。
生物产甲烷的生化代谢途径现状及问题
⽣物产甲烷的⽣化代谢途径现状及问题产甲烷⽣化代谢途径研究进展*⽅晓瑜1,2,3李家宝1,4,5芮俊鹏1,4,5李⾹真1,4,5**1中国科学院环境与应⽤微⽣物重点实验室, 成都⽣物所, 成都6100412中国科学院成都⽣物研究所环境微⽣物四川省重点实验室, 成都6100413中国科学院⼤学, 北京1000494中国科学院⼭地⽣态恢复与⽣物资源利⽤重点实验室, 成都⽣物所, 成都6100415⽣态系统恢复与⽣物多样性保育四川省重点实验室, 成都⽣物所, 成都610041摘要微⽣物产甲烷过程产⽣的甲烷约占全球甲烷产量的74%。
产甲烷过程对⽣物燃⽓⽣产和全球⽓候变暖等都有重要的意义。
本⽂综述了产甲烷菌的具体⽣化代谢途径，其本质是产甲烷菌利⽤细胞内⼀系列特殊的酶和辅酶将CO2或甲基化合物中的甲基通过⼀系列的⽣物化学反应还原成甲烷。
在这⼀过程中，产甲烷菌细胞能够形成钠离⼦或质⼦跨膜梯度，驱动细胞膜上的ATP合成酶将ADP转化成ATP以获得能量。
根据底物类型的不同，可以将该过程分为三类：还原CO2途径、⼄酸途径和甲基营养途径。
还原CO2途径是以H2或甲酸作为主要的电⼦供体还原CO2产⽣甲烷，其中涉及到⼀个最新的发现—电⼦歧化途径；⼄酸途径是⼄酸被裂解产⽣甲基基团和羧基基团，随后，羧基基团被氧化产⽣电⼦供体H2⽤于还原甲基基团；甲基营养途径是以简单甲基化合物作为底物，以外界提供的H2或氧化甲基化合物⾃⾝产⽣的还原当量作为电⼦供体还原甲基化合物中的甲基基团。
通过这三种途径产甲烷的过程中，每消耗1mol底物所产⽣ATP的顺序为还原CO2途径>甲基营养途径>⼄酸途径。
由于产甲烷菌⾃⾝难以分离培养，未来将主要通过现代的⽣物技术和计算机技术，包括基因⼯程和代谢模型构建等最新技术来研究产甲烷菌的⽣化代谢过程以及其与其他菌群之间的相互作⽤机制，以便将其应⽤于⽣产实践。
关键词：产甲烷菌；⽣化代谢；还原CO2途径；⼄酸途径；甲基营养途径CLC Q939.99收稿⽇期Received: 接受⽇期Accepted:*国家重点基础研究发展规划资助项⽬（973项⽬，2013CB733502）；国家⾃然科学基⾦资助项⽬（31300447，41371268）资助Supported by State Key Basic R & D Program of China (973 Program, No. 2013CB733502 ), the National Natural Science Foundation of China (No. 31300447，41371268).**通讯作者Corresponding author (E-mail: lixz@/doc/16e0bd4b30126edb6f1aff00bed5b9f3f80f7230.html )Biochemical pathways of methanogenesis*FANG Xiaoyu1,2,3, LI Jiabao1,4,5 RUI Junpeng1,4,5 & LI Xiangzhen1,4,5**,1Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu, 610041, PR China2Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu, 610041, PR China3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, PR China4Key Laboratory of Mountain Ecological Restoration and Bioresource Utilization, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, PR China 5 Ecological Restoration Biodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, PR ChinaAbstractMicrobial methanogenesis accounts for approximately 74% of natural methane emission. The processes play major roles in global warming and are important for bioenergy production. This paper reviews the biochemical pathways of methanogenesis. It is currently accepted that methanogenesis proceeds via three biochemical pathways depending on the carbon sources, including hydrogenotrophic, aceticlastic, and methylotrophic methanogenesis. Multiple enzymes and coenzymes are involved in the processes, during which Na+ or proton gradient is created across the cell membrane, contributing to limited A TP synthesis. In the hydrogenotrophic pathway, CO2 is reduced to methane with H2 or formate as an electron donor. In the aceticlastic pathway, acetate is split into methyl and carboxyl group, then the carboxyl group is oxidized to produce H2 which is used as the electron donor to reduce methyl group. In the methylotrophic pathway, methyl group is reduced with external H2or reducing equivalent from the oxidation of its own methyl group. The A TP gains per mole substrate for different pathways are as follows: hydrogenotrophic > methylotrophic > aceticlastic pathway. Due to the unculturability of most archaeal methanogens, new technologies, such as bioinformatics, gene engineering and modelling, could be applied to investigate the biochemical pathways of methanogenesis, and the relationship between methanogens and other microbial communities.Keywords methanogen; methanogenesis; biochemical pathways; CO2-reducing; methylotrophic; aceticlastic methanogenesisCLC Q939.99产甲烷菌在地球碳循环中扮演着重要⾓⾊，是有机物厌氧降解的末端功能类群，能够将有机碳转化为甲烷。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
陆吉学 等/生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展Chinese Journal of Biotechnology/cjbcn July 25, 2015, 31(7): 1015−1023DOI: 10.13345/j.cjb.140517 ©2015 Chin J Biotech, All rights reservedReceived : October 28, 2014; Accepted : January 19, 2015Supported by : National Natural Science Foundation of China (Nos. 21336009, 41176111, 41306124), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2013121029).Corresponding author : Baishan Fang. Tel: +86-592-2185869; E-mail: fbs@国家自然科学基金 (Nos. 21336009, 41176111, 41306124), 中央高校基本科研业务费专项资金 (No. 2013121029) 资助。
生物工程学报生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展陆吉学1，王世珍1,2，方柏山1,21厦门大学化学化工学院，福建 厦门 3610052厦门市合成生物技术重点实验室，福建 厦门 361005陆吉学, 王世珍, 方柏山. 生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展. 生物工程学报, 2015, 31(7): 1015–1023. Lu JX, Wang SZ, Fang BS. Advances in biomolecular machine: methane monooxygenases. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1015–1023.摘 要: 甲烷氧化菌中的甲烷单加氧酶能够在生理条件下选择性地以甲烷和氧气为底物生成甲醇，麻省理工学院的Lippard 教授称它为“神奇的生物分子机器”。
本文重点对生物分子机器甲烷单加氧酶的结构、编码基因及调控机制、催化反应机理等进行了综述，此外也简要介绍了甲烷单加氧酶的产生菌甲烷氧化菌的研究历史及分类。
生物分子机器甲烷单加氧酶可催化甲烷氧化成甲醇，不仅为甲醇的生产提供了一种新颖的生产方法，而且对生物分子机器的设计也有借鉴意义。
关键词: 甲烷单加氧酶，生物分子机器，甲烷氧化菌，机理，甲烷Advances in biomolecular machine: methane monooxygenasesJixue Lu 1, Shizhen Wang 1,2 , and Baishan Fang 1,21 Department of Chemical and Biochemical Engineering , University of Xiamen , Xiamen 361005, Fujian , China2 Xiamen Key Laboratory of Synthetic Biotechnology , Xiamen 361005, Fujian , ChinaAbstract: Methane monooxygenases (MMO), regarded as “an amazing biomolecular machine”, catalyze the oxidation of methane to methanol under aerobic conditions. MMO catalyze the oxidation of methane elaborately, which is a novel way to catalyze methane to methanol. Furthermore, MMO can inspire the biomolecular machine design. In this review, we introduced MMO including structure, gene and catalytic mechanism. The history and the taxonomy of MMO were alsoISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech July 25, 2015 Vol.31 No.7/cjbcnintroduced.Keywords : methane monooxygenases, biomolecular machine, methanotrophs, mechanism, methane1959年，第29届美国物理学会年会上美国著名物理学家理查德•费曼 (Richard Feynman) 演讲中首次提出人工分子机器的概念[1]。
分子机器被定义为一种纳米水平的装置，它可以把化学能、电能和光能转化成机械能，人体则可以看成纳米分子机器的集合体[2]。
而生物分子机器 (Biological molecular machine) 被定义为能够利用ATP 水解释放的化学能转变为机械能的蛋白分子[1]。
这种对生物分子机器的定义比较狭窄，实际上Balzani 等认为分子机器可定义为把一些分散的分子聚集到一起，在外部驱动力的作用下，它的组成部分有相对位置的变化，表现出类似于机械一样的运动的分子[2]。
生物催化涉及到的小分子底物反应，通常由自然界中大分子的蛋白和蛋白复合物来催化完成[3]。
甲烷单加氧酶是一种复杂的大分子蛋白复合物，它在催化甲烷生成甲醇的过程中伴随着外部驱动力化学能的输入，促使甲烷单加氧酶亚基之间或亚基中的氨基酸侧链之间发生相对运动[3]，Lippard 教授把甲烷单加氧酶称为神奇的生物分子机器[4]。
生物分子机器甲烷单加氧酶 (Methanemonooxygenases ，MMO) 来自于甲烷氧化菌 (Methanotrophs)。
这些细菌是甲基营养型革兰氏阴性菌，特点是能以甲烷为唯一碳源和能源进行生长繁殖，甲烷氧化菌可用于生产虾青素、单细胞蛋白、聚β-羟基丁酸等附加值高的产品；此外由于甲烷氧化菌特有的甲烷单加氧酶底物谱较广使得甲烷氧化菌在重金属、有机物污染的生物修复方面具有潜在的应用价值[5]，如甲烷单加氧酶在降解卤代烃过程中起着关键作用[6]；甲烷单加氧酶也能够在温和条件下巧妙地催化具有极高键能的甲烷C–H 键 (104 kcal/mol) 氧化生成甲醇[7]；甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶的这些特性使甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶成为研究的热点[8]。
1 甲烷单加氧酶产生菌甲烷氧化菌是生物分子机器甲烷单加氧酶的产生菌。
荷兰微生物学家Söhngen 于1906年首先发现了一株可以利用甲烷的细菌，后被命名为甲烷芽胞杆菌Bacillus methanicus [9]。
Whittenbury 等通过对100多株甲烷氧化菌的研究，初步建立了甲烷氧化菌的分类方案，并根据形态学、细胞质内膜等的精细结构、细菌休眠期的形式等把甲烷氧化菌分成甲基弯曲菌属Methylosinus 、甲基孢囊菌属Methylocysti 、甲基单胞菌属Methylomona 、甲基杆菌属Methylobacte 、甲基球菌属Methylococcus 5个属[10]。
这种分类法提供了甲烷氧化菌的分类框架，它与目前被广泛接受的分类法很相似。
Bowman 等利用 16S rRNA 系统分析法解决了许多菌种命名的难题[11]。
现在主要根据碳源同化路径、细胞质内膜的显微结构、脂肪酸碳链长度、系统发育、DNA mol% G+C 含量和细菌休眠期形式等把甲烷氧化菌分为Ⅰ型、Ⅱ型和X 型[11-12]。
Ⅰ型甲烷氧化菌属于变形杆菌纲γ亚纲，此类甲烷氧化菌的特征是：细胞质内的膜贯穿细胞形成多气泡碟片状束；碳的同化路径是磷酸核糖路径；特征性脂肪酸的碳链长度为14C 和16C [11-14]。
陆吉学 等/生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展cjb@II 型甲烷氧化菌属于变形杆菌纲的α亚纲，其特征为：细胞质内的膜成对齐的线型排布在细胞的外围；利用丝氨酸路径同化碳源；特征性脂肪酸的碳链长度为18C [11-16]。
X 型甲烷氧化菌包括Methylococcus和甲基暖菌属Methylocaldum ，此类甲烷氧化菌兼有Ⅰ型、Ⅱ型甲烷氧化菌的特性，甲醛的主要代谢途径是RuMP 路径且有Serine 路径，此类型细菌耐热性较强[13-14]。
2 甲烷单加氧酶生物分子机器甲烷的C–H 键能高，性质稳定，工业生产甲烷的条件非常苛刻，反应温度和压力甚至分别高达900 ℃和1.1×107 Pa [17]。
甲烷氧化菌特有的甲烷单加氧酶则能在温和条件下无污染地实现甲烷到甲醇的转化，并在一系列脱氢酶的作用下生成二氧化碳和水。
Lippard 教授曾在Nature 杂志上发表过数篇有关MMO 研究方面的文章，在他的主页介绍中称MMO 为“Anamazing biomolecular machine” (神奇的生物分子机器)[4]。
MMO 是甲烷氧化菌的特征酶，可分为2种类型：细胞质内可溶性甲烷单加氧酶 (Soluble methane monooxygenase ，sMMO) 和膜结合的颗粒状甲烷单加氧酶 (Particulate methane monooxygenase, pMMO)，这2类酶都能够催化甲烷生成甲醇，sMMO 可利用的底物范围较广泛可以氧化包括芳香族类的化合物，pMMO 底物专一性较强，只能氧化短碳链化合物[18]。
2.1 可溶性甲烷单加氧酶sMMO 底物范围宽，不仅能够氧化甲烷，还可以氧化短链烷烃、烯烃及芳香族化合物[19]。
sMMO 组成复杂，由羟化酶 (MMOH)、蛋白B (MMOB) 和还原酶 (MMOR) 3个部分蛋白组成。
其中MMOH 分子量为251 kDa ，以α、β、γ三个亚基构成的二聚体 (αβγ)2 形式存在。
羟化酶的α亚基具有μ-氧桥双铁活性中心。
蛋白B 分子量为16 kDa ，可以调解sMMO 的催化反应，它在MMOH 的双铁活性中心催化底物羟基化时具有耦合电子的作用；MMOR 分子量为 39 kDa ，含有双铁-双硫[2Fe-2S]簇和一个辅酶FAD ，此部分酶具有还原作用，还原力的来源由NAD(P)H 提供[3,17]。
sMMO 的基因簇大小为5.5 kb ，其排列顺序是mmoXYBZDC ，它们分别编码羟化酶的α亚基、羟化酶的β亚基、调控蛋白B 、羟化酶的γ亚基、MMOD 蛋白和还原酶C [19-20]。