几种菌种的保存及复苏方法(材料特制)
菌种安全保藏方法
菌种安全保藏方法菌种安全保藏方法点击：23食用菌由于生产投入少，经济效益高，近年来在农村兴起了食用菌生产热潮。
生产中食用菌菌丝繁殖快，容易老化，菌种保藏更难。
下面介绍七种简单易行的菌种保藏方法供广大农户参考：蒸馏水法适用于平菇、金针菇、香菇的苗种。
1、保藏平菇、金针菇菌种先将八成熟待保藏试管菌种移入接种箱内灭菌后，用注射器从试管栓内注入蒸馏水，将培养基面全部淹没至管口2厘米为止。
管口用矿蜡封闭，常温下置于阴凉处立放可以保藏1～1.5年。
2、保藏香菇、木耳菌种，用150×15毫米的指型管将培养至7成熟的固体或半固体试管种在接种箱内无菌操作下，放人25×200毫米的大试管内，向大试管内注入蒸馏水至管口1厘米处，封口用橡皮栓包好，并用矿蜡加固密封，置于阴凉处。
木耳可保藏7～8个月，香菇可保藏9～12个月。
此法在自然温度下也可以保藏其他菌种。
尿素暂存法在避光、干燥通风良好的地方放置袋装尿素，将试管菌种主体埋在尿素颗粒中，试管口露在外面，可保藏菌种活力30天之多。
此法在恒定低温环境下即可进行。
液体石蜡保藏法选用化学液体石蜡，高压灭菌后放入40℃恒温箱中数小时或干燥器中数日，用无菌吸管或注射器吸取液体石蜡注入菌种试管。
注入量应高出斜面尖端1厘米左右，管口塞上棉塞并用石蜡封好。
直立保藏在清洁、干燥、凉爽的低温处可以保藏5年。
麸皮保藏法取一定麸皮加水或营养液后拌匀即可备用。
将水麸皮装入试管经高压灭菌后拌入菌种，放在适温下培养，待菌丝体发育好后将试管放入室温下进行干燥。
然后在20℃以下干燥处保藏，可保藏3～5年。
生理盐水保藏法将菌种接入马铃薯培养液中，每250毫升三角瓶装60毫升养液，振动培养液或每天摇动5～10次，培养5～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5毫升无菌生理盐水的试管中，每管约移入4～5个菌丝球，塞上棉塞，用蜡封好管口。
低温可保藏1年。
麦粒保藏法取优质小麦淘洗后浸入20℃水中泡5小时，稍晾干后装管。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存引导语：菌种应该怎么保存呢?以下是小编收集整理的关于菌种保藏方法相关内容，欢迎阅读参考!菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
食用菌菌种保藏的方法
食用菌菌种保藏的方法
食用菌是一种广泛使用的食品，如何保存食用菌的菌种是非常重要的。
下面介绍几种常用的菌种保藏方法。
一、冷冻法
冷冻法是将菌种置于低温下，使其处于冷冻状态以达到保藏的目的。
将菌丝均匀地涂于平板上，置于-80℃的低温冷冻柜中冷冻，或将菌丝混入15%甘油溶液中，用液氮冷冻保存。
这种方法保存的菌种质量较好，保藏时间较长。
二、干燥法
将菌丝培养在无菌环境下，培养到菌丝生长至顶部时，用无菌石英砂或无菌滤纸吸干培养皿内的水分，再将石英砂或滤纸中的菌种置于无菌条件下进行干燥，然后密封保存。
这种方法使用简单，保存时间较长，但保存的菌种易受到氧气、温度和湿度等因素的影响。
三、冷藏法
冷藏法是将培养好的菌种置于低温环境下进行保存。
将培养好的菌种涂于平板上，进行初步培养，再将平板用无菌纸包好，置于4℃的冰箱中保存。
这种方法保存的菌种质量较好，但保存时间较短。
四、液氮保存法
将培养好的菌种混入15%甘油溶液中，用液氮冷冻保存。
这种方法保存的菌种质量较好，保存时间长达数年，但需要液氮存储设备。
五、糖分保藏法
将培养好的菌种混入10%蔗糖水溶液中，用常温保存。
这种方法保存的菌种质量较好，保存时间长达数年，但需要注意保藏容器的密封性。
不同的菌种保藏方法适用于不同的情况，我们需要根据实际情况选择合适的方法。
同时，在进行菌种保藏时，需要注意保藏容器的密封性、温度、湿度等因素，以确保保存的菌种质量。
长期保藏食用菌菌种的方法有哪些？
长期保藏食用菌菌种的方法有哪些？（1）矿物油保藏法。
食用菌的菌丝体都可用此法保藏。
矿物油即指质量好的医用液体石蜡。
在试管斜面上灌注液状石蜡可以防止培养基水分的散失；使菌丝体与空气隔绝，以降低新陈代谢，从而达到保藏的目的。
此法保藏菌种一般可贮藏 2～3年，但最好每1～2年移植1次；加了石蜡的菌种，置于室温下保藏比放在冰箱内更好。
将100毫升液状石蜡倒入250毫升三角瓶中，在121℃下灭菌2小时，再在40℃煤箱中烘烤几小时，蒸发水分备用。
然后在无菌操作条件下，在培养好了的斜面菌种上注入一层液状石蜡，注入量以高出斜面尖端1厘米为度。
使用矿物油保藏时，菌种必须置在小铁丝篓或试管架上垂直存放。
由于棉塞易受污染，最好将棉塞齐管口剪平，用矿蜡密封后再以塑料薄膜包扎贮于清洁、避光的木柜中。
（2）沙土保藏法。
此法比较简单方便，将食用菌的孢子保藏在干燥的无菌沙土中。
沙土装入小试管中，要经过严格灭菌后再将无菌孢子拌入沙中，用石蜡封口，放在盛有干燥器的大试管中密封保存。
（3）菌丝球生理盐水保藏法。
将待保藏菌种，在无菌操作下接入无菌的、不含琼脂的液体 PDA 培养基中，每250毫升三角瓶装60毫升，用摇床（以旋转式摇床为好）振荡培养5～7天（180转/分钟，25℃），然后将形成的菌丝球用无菌吸管吸入装有5 毫升无菌生理盐水的试管中，每管转入4～5个菌丝球。
试管用石蜡封口，放在4℃冰箱或常温下保藏。
（4）真空冷冻干燥法。
真空冷冻干燥法主要是采用真空、干燥和低温等三种手段对菌种进行保藏。
这种保藏方法对菌种的保藏期长，10～20年后仍不降低菌种原有的性能。
其保存的基本方法是将需要保藏的菌种悬浮液装在特制的安培管中，然后骤然冰冻，并立即抽真空，使培养物以固体形态升华脱水，熔封后在低温下保藏。
（5）液氮超低温保藏法。
液态氮温度在—195℃，由于液态氮的超低温能使食用菌的代谢水平降到最低限度，因此，采用液态氮超低温冰箱保藏法，能够保藏所有的微生物菌种，包括一些不能用冷冻干燥法保藏的菌种，甚至不耐低温的草菇菌种如用10%的甘油和5%～10%的二甲基矾做保护剂，也能在超低温冰箱中保藏。
食用菌类栽培中的菌种保存与管理
食用菌类栽培中的菌种保存与管理菌种保存与管理在食用菌类栽培中起着至关重要的作用。
正确的保存和管理方法能够保证菌种的活力和纯度，从而提高菌丝的生长速度和产量。
本文将介绍几种常用的菌种保存与管理的方法。
一、菌种保存方法1. 冷冻保存法：冷冻保存是目前常用的一种菌种保存方法。
首先，将需要保存的菌种培养在含有适宜营养物质的琼脂平板上，进行培养。
然后，选择菌落良好、生长健壮的菌株进行保存。
将菌株切取一小块，放入无菌的保存管中，加入适量的冷冻保护剂，如甘油或乳糖。
最后，将保存管密封并放入低温冷冻箱中保存。
2. 雪藏保存法：雪藏保存也是一种常见的菌种保存方法。
首先，将需要保存的菌种培养在琼脂平板上。
然后，将培养好的菌落切取一小块，放入无菌的冰醋酸纤维素管或PCR管中。
接下来，将菌种在-80℃的环境中迅速冷冻至冰冻状态。
最后，将冷冻好的菌种保存在液氮罐中。
3. 干燥保存法：干燥保存法适用于某些特殊的菌种，可以有效地保护菌种的特殊形态。
首先，将需要保存的菌株培养在琼脂平板或液体培养基中。
接着，取一部分菌株，在无菌环境下置于无菌纸上，用干燥器或者通风处进行干燥。
最后，将完全干燥的菌株保存在无菌瓶中，密封保存。
二、菌种管理方法1. 菌种记录：在食用菌类栽培中，菌种管理的第一步是建立完整的菌种记录。
每个菌株需要有唯一的编号，记录培养的来源、传代次数、保存方法等信息。
同时，应建立菌种保存的数据库，记录每个菌株的详细信息，以便随时查询和管理。
2. 菌种传代：菌种的传代是菌种管理的重要环节。
传代是指将菌株从一个培养基转移到下一个培养基的过程。
在传代过程中，应注意消毒操作，避免外界的污染。
同时，要确保传代的菌株与原始菌株保持一致，不出现突变。
3. 菌种保持：对于长期保存的菌株，应定期复苏和保持活力。
通过以上介绍的保存方法，可以将菌株保存在恰当的条件下。
定期检查保存的菌株，保证其活力和纯度。
如果有发现菌株衰弱或受到污染的情况，应及时更换或重新培养。
保存菌种的方法
保存菌种的方法
保存菌种是微生物学研究中非常重要的一项工作。
菌种可以通过不同的方法进行保存，以保证其长期的存活和保持其特性。
以下是几种常见的保存菌种的方法：
1. 冷冻保存：将菌株培养在富含营养物的培养基上，然后将细菌悬液添加到含有冷冻保护剂的离心管中，将其置于-80℃的冰箱中冷冻保存。
这种方法可以长期保存菌株，但需要注意冻存液的配制以及冷冻和解冻的操作。
2. 干燥保存：将菌株在富含营养物的培养基上生长，将其转移到无菌纸片上，然后在室温下晾干并密封保存。
这种方法不需要低温保护，但需要在干燥的条件下保存，并且菌株的保存时间较短。
3. 防冻干保存：将菌株培养在富含营养物的培养基上，然后将其转移到无菌滤纸片上，在防冻干剂的条件下进行干燥处理，并在干燥后密封保存。
这种方法可以在室温下保存菌株，并且可以长期保存，但需要注意干燥和密封的条件。
4. 长期冷藏保存：将菌株培养在富含营养物的培养基上，然后在4℃的冰箱中长期保存。
这种方法简便易行，但保存时间较短，通常不超过6个月。
需要注意的是，保存菌株的方法应根据不同的菌株和实验需求来选择。
保存菌株时也需要注意无菌操作，选择适当的保存容器和保存条件，并及时更新保存记录，以保证菌株保存的质量和可靠性。
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几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。
适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。
2.1.4 密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。
能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。
2.1.5 挖块接种法挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。
适用灵芝等担子菌类真菌。
2.2 穿刺接种用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。
适用于细菌和酵母菌等。
2.3 液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。
3 培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。
细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。
4 保藏培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。
某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。
保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。
斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。
液体石蜡保藏法亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。
是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 液体石蜡的准备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。
160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。
2 斜面培养物的制备参照定期移植法。
3 灌注石蜡将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。
4 保藏4.1注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。
4.2保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。
5 恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 用于白色念珠菌复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。
然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。
将此被污染了的培养物灭菌处理。
可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。
并重新制备储备菌种管3.6菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。
菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。
菌种的传代保藏过程3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。
传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时，工作用菌种为第3代。
工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
（3）关闭紫外灯。
点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。
按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。
菌种斜面的培养、保藏条件及时间菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001) 23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月黑曲霉(CMCC(F)98003) 23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。
如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作，都应进行记录。