番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP标记检测.

园艺学报 2014，41（10）：2012–2020 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP 标记检测苏晓梅*，高建昌*，王孝宣，国艳梅，杜永臣，胡鸿**（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 10081）摘 要：针对番茄4个抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1，根据其序列的碱基差异设计引物，经过引物特异性检测和PCR产物克隆测序比对之后，采用高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）技术进行多态性检测，共开发了5个SNP标记。

经过验证，所开发的标记均能将抗病基因型不同的番茄材料分型，并且分型结果与已知材料的抗病性状完全一致。

这些标记可以作为功能标记在番茄抗病育种中应用。

关键词：番茄；抗病基因；功能标记；HRM中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2012-09 Detection of SNP Markers of the Important Disease Resistance Genes in TomatoSU Xiao-mei*，GAO Jian-chang*，WANG Xiao-xuan，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，and HU Hong**（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）Abstract：According to the gene sequence differences，primers were designed for 4 disease resistance genes in tomato，Tm-2，Pto，Sw-5 and Ve1. After checking of primer specificity and aligning of the clone sequences of the PCR products，the HRM（High resolution melting）technology was used for polymorphism detection. In this study，5 SNPs were developed，all of which could distinguish the materials with different genotypes. What’s more，the genotype was completely consistent with the known gene. So they can be used as functional markers in tomato disease resistance breeding.Key words：tomato；disease resistance gene；functional marker；HRM分子标记辅助选择技术已成为番茄抗病育种的常规手段，但连锁分子标记选择的准确性取决于标记与抗病基因的连锁程度，即便是紧密连锁的分子标记，也会由于在分离后代中出现标记与抗病基因的交换而导致假阳性，降低选择效率。

抗病基因的功能标记（基因内部标记）是其特异性标记，其选择准确率为100%（Arens et al.，2010），能够克服连锁标记的缺点。

收稿日期：2014–05–20；修回日期：2014–07–24基金项目：国家‘863’计划项目（2012AA100103）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-A-09）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目* 同等贡献作者** 通信作者Author for correspondence（E-mail：huhong@）10期苏晓梅等：番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP标记检测2013SNP（单核苷酸多态性，Single nucleotide polymorphism）是由单个碱基变异（替代、插入或缺失）所导致的多态性，在番茄基因组上广泛分布。

通常对SNP的检测有直接测序、Taq Man探针、CAPS、dCAPS和HRM等方法（Gut，2001；Syvänen，2001）。

但这些方法有的比较昂贵（直接测序、Taq Man探针）；有的很难找到合适的酶切位点且检测步骤相对复杂（如CAPS和dCAPS）。

高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）技术是近年来新发展起来的一种SNP检测技术（Gundry et al.，2003；Wittwer et al.，2003），是目前仅次于SNP芯片的中高通量SNP分型技术（赵琼一等，2010），其原理是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，获得稳定PCR产物的特征熔解曲线，进而根据其形态改变来判断扩增DNA片段在长度、碱基序列和GC含量等方面的差异。

SNP位点因不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型，该方法适合单一SNP的检测。

目前番茄（Solanum lycopersicum）中已有的抗病标记多为连锁标记，在抗病鉴定中易发生交换导致结果不准确或是鉴定过程比较复杂，稳定性差。

番茄抗病基因Tm-2（Tobacco mosaic virus resistance-2，抗烟草花叶病毒）（Motoyoshi et al.，1996）、Pto（Pseudomonas syringae pv tomato resistance，抗细菌性斑点病）（Martin et al.，1993）、Sw-5（Spotted wilt resistance-5，抗斑萎病）（Brommonschenkel et al.，2000；Spassova et al.，2001）和Ve1（Verticillium resistance，抗黄萎病）（Kawchuk et al.，2001）已被克隆，并且在番茄抗病育种中应用较为广泛，但在抗病鉴定中缺少简便有效的标记。

在Tm-2基因的抗病鉴定中常用的标记为SCN13（Sobir et al.，2000），该标记在试验过程中稳定性较差，扩增效率低。

在Pto基因的抗病鉴定中最常用的是Yang和Francis（2005）根据基因序列开发的CAPS功能标记，该标记为共显性标记，需要经过酶切检测，过程比较复杂。

在Sw-5基因的抗病鉴定中常用的标记有CAPS标记CT220（Garland et al.，2005）和InDel标记Sw5-2（Dianese et al.，2010），前者为连锁标记，后者虽为功能标记但稳定性较差，扩增效率低，容易出现假阳性。

在Ve1基因的抗病鉴定中最常用的是Acciarri等（2007）根据Ve1基因序列设计的等位基因特异引物，在抗病材料中扩增出1 001 bp的片段，而在感病材料中扩增出696 bp的片段，在杂合材料中能扩增出1 001 bp和696 bp的两个片段，虽然该标记为基因内部的功能标记，但由于需要两对引物分别进行扩增，故操作过程繁琐且结果重复性差，不稳定。

本研究以开发上述4个基因的功能标记为目标，通过序列比对，寻找SNP位点，建立基于HRM技术的SNP检测方法，以期为抗病育种提供检测平台，提高抗病材料的选择效率。

1 材料与方法1.1试验材料利用20个已知基因型的番茄材料（表1）对开发的功能标记进行验证。

GCR系列引自日本，LA系列、M82、Micro-Tom和Moneymaker（http：//tgrc. ucdavis. edu）引自TGRC（Tomato Genetics Resource Center，番茄遗传资源中心），L305引自美国夏威夷，飞天为海泽拉公司的杂交种，V217为法国威玛公司的杂交种，Fla.8042（http：//tgc. ifas. ufl. edu/index. htm）和Micro-Tom（http：//tgrc. ucdavis. edu）引自美国弗罗里达大学，早粉2号和9706由中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜食番茄组提供，Moneymaker为感病对照。

其中用于Tm-2和Ve1基因测序验证的材料为9706和Moneymaker，用于Pto基因测序的为Micro-Tom和Moneymaker，用于Sw-5基因测序的为Fla.8042和Moneymaker。

2012年8月12日浸种，8月16日于中国农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室内播种。

2014 园艺学报41卷表1 番茄材料及其基因型Table 1 Genotype of the tomato materials品种Variety 基因型Genotype品种Variety基因型GenotypeGCR26 tm-2/tm-2①；ve1/ve1③早粉2号 Zaofen 2 sw-5/sw-5GCR526 Tm-2/Tm-2②M82 sw-5/sw-5GCR237 tm-2/tm-2①LA0409 Ve1/ Ve1LA3028 Tm-2/Tm-2 LA2818 Ve1/Ve1LA3310 Tm-2/Tm-2 LA2823 Ve1/Ve1LA2934 Pto/Pto Moneymakertm-2/tm-2，pto/ptoLA4441 pto/pto sw-5/sw-5，ve1/ve1LA3856 pto/pto 9706 Tm-2/Tm-2，pto/ptoL305 pto/pto sw-5/sw-5，Ve1/ Ve1飞天 Feitian Sw-5/sw-5 Micro-Tom tm-2/tm-2，Pto/PtoV217 Sw-5/sw-5sw-5/sw-5，Ve1/ Ve1Fla.8042 Sw-5/Sw-5①Strasser & Pfitzner，2007；②Stobbs & MacNeill，1980；③Fradin et al.，2009。