与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl连锁的标记及应用
番茄抗黄化曲叶病基因Ty-2的分子标记及种质资源初步鉴定
番茄抗黄化曲叶病基因Ty-2的分子标记及种质资源初步鉴定王宁;李景富;李会佳【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2015(41)1【摘要】以抗番茄黄化曲叶病毒病材料‘CLN2498D’为父本,感病材料‘早粉2号’为母本,以其F2代为研究对象,采用AFLP及SSR两种标记方法,筛选与Ty-2基因连锁的标记.通过对256对AFLP引物及30对SSR引物的筛选,共获得5个AFLP标记和2个SSR标记与Ty-2基因连锁,其中标记E02M11距离目标基因5.8cM,另有3个标记距离均在10 cM以内.将标记E02 M11用于30份番茄材料的种质资源筛选,获得12个含有该标记的番茄材料,为番茄抗黄化曲叶病毒育种工作提供基础.【总页数】6页(P78-83)【作者】王宁;李景富;李会佳【作者单位】东北农业大学园艺学院,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院,哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S436.412.11【相关文献】1.番茄种质抗黄化曲叶病毒病 Ty-1基因的分子标记分析与田间抗病评价 [J], 张前荣;朱海生;刘建汀;李永平;康建坂;王彬;李大忠;薛珠政;温庆放2.抗番茄黄化曲叶病基因Ty-2的SSR新标记 [J], 杨玛丽;赵统敏;余文贵;赵丽萍3.番茄新品种黄化曲叶病毒病抗性基因Ty1、Ty3的分子标记 [J], 刘燕;尚春明;高振江;王伟;周刚;郑于莉;姚慧静4.番茄抗黄化曲叶病毒病基因的AFLP分子标记 [J], 姚金晓;杨悦俭;叶青静;王荣青;阮美颖;周国治;姚祝平5.番茄新品种黄化曲叶病毒病抗性基因Ty1、Ty3的分子标记 [J], 刘燕;尚春明;高振江;王伟;周刚;郑于莉;姚慧静;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种
浙江大学学报（农业与生命科学版） ３６（３）：２５５～２６１，２０１０ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ畅＆ＬｉｆｅＳｃｉ畅）文章编号：１００８‐９２０９（２０１０）０３‐０２５５‐０７ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８‐９２０９．２０１０．０３．００３ 收稿日期：２０１０‐０１‐２５基金项目：浙江省农业重大科技攻关资助项目（２００９Ｃ０２００６‐１）；浙江省面上科研农业资助项目（２００７Ｃ３２０１１）．作者简介：周国治（１９６６－），男，浙江诸暨人，副研究员，主要从事番茄育种方面的研究．通信作者：杨悦俭，男，研究员，主要从事番茄育种方面的研究．Ｔｅｌ：０５７１‐８６４０４１７７；Ｅ‐ｍａｉｌ：ｙｏｕｎｇｈｚ＠１６３．ｃｏｍ．胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种周国治，叶青静，王荣青，阮美颖，杨悦俭（浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州３１００２１）摘 要：为获得番茄抗根结线虫杂种，以含有温度敏感型抗根结线虫Ｍｉ‐１基因的高代优良自交系栽培番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） ５６７８１６１＂为母本，与含有非温度敏感型抗根结线虫Ｍｉ‐３基因的秘鲁番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ） ＬＡ２８２３＂为父本进行杂交，通过胚挽救技术获得１０个胚挽救苗株系；应用序列相关扩增多态性（ＳＲＡＰ）分子标记技术对胚挽救苗进行亲子鉴定，证实杂种的真实性；利用Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３基因的特异引物对杂种植株进行分子检测，从杂种中检测出拥有Ｍｉ‐１基因标记的后代１０株，同时拥有Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３基因标记的后代１株．关 键 词：番茄；抗根结线虫；胚挽救；序列相关扩增多态性（ＳＲＡＰ）；分子标记辅助选择中图分类号：Ｓ３３６；Ｑ３２ 文献标志码：ＡＺＨＯＵＧｕｏ‐ｚｈｉ，ＹＥＱｉｎｇ‐ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧＲｏｎｇ‐ｑｉｎｇ，ＲＵＡＮＭｅｉ‐ｙｉｎｇ，ＹＡＮＧＹｕｅ‐ｊｉａｎ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２１，Ｃｈｉｎａ）Ｈｙｂｒｉｄｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｏｆｔｏｍａｔｏｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｅｍｂｒｙｏ‐ｒｅｓｃｕｉｎｇａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ‐ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ畅＆ＬｉｆｅＳｃｉ畅），２０１０，３６（３）：２５５‐２６１Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｏｂｔａｉｎｈｙｂｒｉｄｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｏｆｔｏｍａｔｏ，ｂｒｅｅｄｉｎｇｌｉｎｅ ５６７８１６１＂ｃａｒｒｙｉｎｇＭｉ‐１ｇｅｎｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔａｎｄｗｉｌｄｔｏｍａｔｏ ＬＡ２８２３＂ｃａｒｒｙｉｎｇＭｉ‐３ｇｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔ．Ｔｅｎｈｙｂｒｉｄｌｉｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｅｍｂｒｙｏｒｅｓｃｕｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｓｒｅａｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）ｍｅｔｈｏｄ．ＴｅｎｐｌａｎｔｓｗｉｔｈＭｉ‐１ｇｅｎｅａｎｄｏｎｅｐｌａｎｔｂｏｔｈｗｉｔｈＭｉ‐１ｇｅｎｅａｎｄＭｉ‐３ｇｅｎｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｏｕｔｂｙｕｓｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏＭｉ‐１ｇｅｎｅａｎｄＭｉ‐３ｇｅｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｏｍａｔｏ；ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅ；ｅｍｂｒｙｏｒｅｓｃｕｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ‐ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ 随着保护地蔬菜栽培面积的迅速扩大，受保护地密闭、高温、高湿和复种指数增加等因素影响，番茄根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ）病呈逐年加重趋势，已成为番茄生产中的严重障碍之一，一般可造成减产１０％～２０％，严重时可达７０％以上，甚至绝收［１‐２］．根结线虫在土壤中分布广泛，传播途径很多，可以通过病土、病根、带病幼苗、水流、人畜活动、农具及农事操作等途径传播，防治困难．培育抗病品种是防治番茄根结线虫病最经济、最有效的措施．浙江大学学报（农业与生命科学版） 目前国际上从番茄的近缘野生种中发现了９个抗根结线虫基因，即：Ｍｉ‐１、Ｍｉ‐２、Ｍｉ‐３、Ｍｉ‐４、Ｍｉ‐５、Ｍｉ‐６、Ｍｉ‐７、Ｍｉ‐８、Ｍｉ‐９［３‐４］，其中，Ｍｉ‐１、Ｍｉ‐７、Ｍｉ‐８表现为温度敏感型，即当土壤温度超过２８℃时，这３个基因对根结线虫的抗性丧失；Ｍｉ‐２、Ｍｉ‐４、Ｍｉ‐５、Ｍｉ‐６表现为非温敏型，当土壤温度为３２℃时仍然对根结线虫具有抗性［３］；Ｍｉ‐３基因位于番茄第１２条染色体短臂上，与Ｍｉ‐５基因紧密连锁，是非温敏的必须基因［３，５‐６］．Ｍｉ‐１基因是目前栽培番茄中唯一已被鉴定和利用的抗根结线虫病基因． Ｍｉ‐３基因存在于秘鲁番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）中，秘鲁番茄是番茄属中开发利用最少的近缘野生种，这主要是由于秘鲁番茄和栽培番茄亲缘关系较远，它们的种间杂种早期胚胎发生败育［７］，这直接限制了该基因的应用．研究表明，通过胚胎挽救方法能够在一定程度上克服这一障碍［８］．国内已有关于栽培番茄与秘鲁番茄杂交的报道［９］．但关于将Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３抗性基因聚合的研究甚少，尚未见含有Ｍｉ‐３基因的栽培番茄商品种（系）育成． 本研究通过将含有Ｍｉ‐１基因的栽培番茄 ５６７８１６１＂与含有Ｍｉ‐３基因的秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂杂交后，采用胚挽救技术获得杂交后代；利用ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分子标记分析技术，从ＤＮＡ水平上鉴定杂种的真实性；分析亲本及杂交后代间的遗传差异性和相似性，进行栽培番茄与秘鲁番茄种间杂种的核酸指纹鉴定，为进一步转育秘鲁番茄的抗病性与抗逆性奠定基础；利用Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３基因的特异引物，选择具有Ｍｉ‐１和／或Ｍｉ‐３基因的番茄抗根结线虫新种质，为番茄抗根结线虫育种提供新种质，对选育抗根结线虫番茄新品种具有重要意义．１ 材料与方法１畅１ 杂交授粉 ２００９年５月上旬在浙江省农业科学院蔬菜研究所番茄育种基地进行．抗青枯病的栽培番茄 ５６７８１６１＂含有温度敏感型抗根结线虫基因Ｍｉ‐１，秘鲁番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ） ＬＡ２８２３＂含有非温敏感型抗根结线虫基因Ｍｉ‐３．以栽培番茄 ５６７８１６１＂为母本，秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂为父本进行种间杂交，采用人工去雄和人工授粉的方法，于２００９年６月采集幼胚进行组培．１畅２ 胚挽救步骤 杂交幼胚组培在浙江省农业科学院蔬菜研究所组织培养实验室进行．２００９年６月采集杂交种子，取其幼胚进行组培．具体操作程序如下：１）材料消毒：利用常规技术对授粉后３５～５０ｄ的幼果进行灭菌．先用７０％酒精灭菌１ｍｉｎ，再用０畅１％ＨｇＣｌ２灭菌１０ｍｉｎ（加２～３滴吐温），然后用无菌水浸泡冲洗３次以上．２）接种：用灭菌后的手术刀切开幼果，剥去种皮，取出胚，接种在１／２ＭＳ＋２ｍｇ爛Ｌ－１ＢＡ＋１ｍｇ爛Ｌ－１ＮＡＡ＋０畅１％活性炭的培养基上．３）胚培养：培养室保持恒温（２５±１）℃，胚发育阶段每天１２ｈ光照，光照强度为３０００ｌｘ．１畅３ 继 代 当幼苗长至４～５片叶时，继代于１／２ＭＳ培养基中，一部分用于培养成苗，另一部分用于提取ＤＮＡ．１畅４ 基因组的提取和检验 采用改良ＣＴＡＢ法［１０］提取杂交幼胚培养的杂种株系基因组ＤＮＡ．１畅５ 杂种鉴定 ＳＲＡＰ‐ＰＣＲ反应体系为１０μＬ，含有：ＤＮＡ模板０畅５μＬ，ｄＮＴＰｓ０畅２μＬ（１０ｍｍｏｌ爛Ｌ－１），上游引物、下游引物各０畅２５μＬ（５０ｎｇ爛μＬ－１），１０×反应缓冲液１μＬ（含２０ｍｍｏｌ爛Ｌ－１Ｍｇ２＋），Ｔａｑ酶０畅２５μＬ（２Ｕ爛μＬ－１），无菌纯水７畅５５μＬ．ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ后；９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ．取１０μＬＰＣＲ产物，加入ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ后，在１畅８％琼脂糖上电泳，电压设定为１３０Ｖ，电泳４ｈ，用ＥＢ染色，Ｂｉｏ‐ＲＡＤ凝胶成像仪拍照记录．１畅６ 分子标记数据处理 ＳＲＡＰ标记的每条带记录为１个位点，有带记为 １＂，无带记为 ０＂．用ＮＴＳＹＳ‐ｐｃ软件６５２第３６卷 周国治，等：胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种计算Ｄｉｃｅ遗传相似性系数（ＧＳ），ＧＳ＝２ａ／（２ａ＋ｂ＋ｃ），其中ａ为任意２品种共享谱带数，ｂ和ｃ为相应２品种间的差异条带［１１］；用ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎ）法进行聚类分析．１畅７ Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３分子标记对杂种植株进行分子检测 番茄抗根结线虫Ｍｉ‐１基因的ＣＡＰＳ标记引物参照已克隆的Ｍｉ簇中Ｍｉ‐１畅２的核苷酸序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＦ０３９６８２）设计［１０］，Ｍｉ０２：５ ‐ＣＴＡＧＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＡＧＧ‐３ ，Ｍｉ２：５ ‐ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧ‐３ ，Ｍｉ‐３基因的ＳＣＡＲ标记引物参照Ｙａｇｈｏｏｂｉ等［１２］的设计，Ｍｉ３‐２Ｆ：５ ‐ＧＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧ‐３ ，Ｍｉ３‐２Ｒ：５ ‐ＴＡＣＣＣＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＴＧＧ‐３ ．引物均由上海生物工程技术公司合成．Ｍｉ‐１基因ＣＡＰＳ标记的引物反应体系及反应程序参照周国治等［１０］的实验方法．Ｍｉ‐３基因ＳＣＡＲ标记的引物反应体系１０μＬ，含有：０畅５μＬＤＮＡ模板，０畅２μＬｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ爛Ｌ－１），Ｍｉ‐３上、下游引物各０畅２５μＬ（５０ｎｇ爛μＬ－１），１μＬ１０×反应缓冲液（含２０ｍｍｏｌ爛Ｌ－１Ｍｇ２＋），Ｔａｑ酶０畅２５μＬ（２Ｕ爛μＬ－１），无菌纯水７畅５５μＬ．优化的ＰＣＲ循环为：先９４℃预变性２ｍｉｎ，然后３５个扩增循环（９４℃变性１ｍｉｎ，５３℃复性５０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ），最后７２℃延伸１０ｍｉｎ．在１畅５％琼脂糖上电泳，用ＥＢ染色，Ｂｉｏ‐ＲＡＤ凝胶成像系统显示．２ 结果与分析２畅１ 利用胚挽救技术获得番茄新种质 以栽培番茄 ５６７８１６１＂为母本，与含有非温度敏感型抗根结线虫Ｍｉ‐３基因的秘鲁番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ） ＬＡ２８２３＂进行杂交．授粉３０～５０ｄ后，采摘８０多个杂交果实，从中得到直径约４ｍｍ的种子４４粒，直径约２ｍｍ的种子１６５粒．将４４粒看似发育成熟的种子中２２粒种子剥去种皮，置于１／２ＭＳ培养基上，４～１５ｄ后，陆续有７粒种子有根状体发生；另外２２粒种子带着种皮置于１／２ＭＳ培养基上，４～８ｄ后，个别种皮变成浅黄色，第２０天，２粒种子有根状体发生，继续培养，其他的２０粒种子变成黑褐色．因直径约２ｍｍ种子的种皮不易剥离，带着种皮置于１／２ＭＳ培养基上，４０ｄ后，只有１粒种子有根状体发生，其他的种子逐渐萎缩．通过胚挽救技术获得胚挽救苗１０个单株．２畅２ ＳＲＡＰ‐ＰＣＲ扩增分析 从上海生物工程技术公司合成的２２０对引物中筛选出扩增带型较好且具有多态性差异的引物共２６对．用筛选的２６对引物对栽培番茄 ５６７８１６１＂（♀）、秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂（♂）以及经胚挽救获得的１０个Ｆ１代单株进行ＰＣＲ扩增，电泳检测结果见图１．共检测到１８６条清晰条带，条带的片段大小在１００～２０００ｂｐ之间，其中多态性条带１５８条，平均每对引物６条，多态性比率为８４畅９％． 在１０个单株之间，谱带存在一些差异，谱带总数、在双亲扩增位点中均可检出的谱带、单独在母本扩增位点检出的谱带、单独在父本扩增位点检出的谱带以及特异带均有不同（表１），单株之间的差异说明在杂交后代中筛选优异材料具有可行性．从表１中可以看出，Ｆ１‐２单株继承父本的能力比其他９个单株强．Ｆ１‐２共扩增出１１２条谱带，单独在父本扩增位点检出的谱带２４条，占谱带总数２１畅４３％，其他９个单株单独在父本扩增位点检出的谱带占谱带总数不到５％． 通过ＳＲＡＰ鉴定，可以明显看出杂种与亲本之间的差异（图１）．ＳＲＡＰ对杂种鉴定可根据Ｆ１代有无父母本的特征带来鉴定其杂交是否成功．在１０个Ｆ１子代中，来自父母的谱带Ｆ１‐１有８８畅３５％，Ｆ１‐２有９２畅８６％，Ｆ１‐３有８８畅０７％，Ｆ１‐４有８７畅１６％，Ｆ１‐５有８５畅４５％，Ｆ１‐６有８６畅１１％，Ｆ１‐７有８７畅９６％，Ｆ１‐８有９３畅４６％，Ｆ１‐９有８７畅３８％，Ｆ１‐１０有８２畅０８％，说明这１０个Ｆ１子代在遗传基础上的确是来自栽培番茄 ５６７８１６１＂和秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂．本试验中Ｆ１代１０个单株中均出现了亲本没有的特异谱带，可能是亲本杂交时染色体交换所引起的．７５２ 第３期浙江大学学报（农业与生命科学版）Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ；１：栽培番茄 ５６７８１６１＂；２：秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂；（３～１２）：Ｆ１代单株（Ｆ１‐１～Ｆ１‐１０）．图１ ＳＲＡＰ引物ＭＥ６‐Ｅｍ１１（Ａ）和ＭＥ６‐Ｅｍ５（Ｂ）的扩增结果Ｆｉｇ．１ ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈｐｒｉｍｅｒｓＭＥ６‐Ｅｍ１１（Ａ）ａｎｄＭＥ６‐Ｅｍ５（Ｂ）表１ 杂交Ｆ１代ＳＲＡＰ‐ＰＣＲ扩增的带数与来源Ｔａｂｌｅ１ ＡｍｏｕｎｔｏｆｂａｎｄｓｏｆＦ１ａｎｄｔｈｅｉｒｏｒｉｇｉｎａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＳＲＡＰ‐ＰＣＲＦ１代单株共扩增谱带／条在双亲扩增位点中均可检出的谱带／条占谱带总数／％单独在母本扩增位点检出的谱带／条占谱带总数／％单独在父本扩增位点检出的谱带／条占谱带总数／％特异带／条占谱带总数／％Ｆ１‐１１０３３３３２．０４５１４９．５１５４．８５１２１１．６５Ｆ１‐２１１２３８３３．９３３９３４．８２２４２１．４３８７．１４Ｆ１‐３１０９３１２８．４４５３４８．６２４３．６７１３１１．９３Ｆ１‐４１０９３１２８．４４５３４８．６２１０．９２１４１２．８４Ｆ１‐５１１０３１２８．１８５２４７．２７４３．６４１６１４．５５Ｆ１‐６１０８３４３１．４９５４５０．００２１．８５１５１３．８９Ｆ１‐７１０８３２２９．６３５２４８．１５５４．６３１３１２．０４Ｆ１‐８１０７３４３１．７８５４５０．４７４３．７４７６．５４Ｆ１‐９１０３３５３３．９８４９４７．５７３２．９１１３１２．６２Ｆ１‐１０１０６３３３１．１３４７４４．３４２１．８９１９１７．９２２畅３ 材料的聚类及多样性分析 利用２６对引物在１２个材料中扩增出１８６条谱带，计算材料之间的相似系数（ＧＳ值）．结果表明，１２个材料ＧＳ值在０畅３３～０畅９２之间，其中秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂与Ｆ１‐５的ＧＳ值最低，为０畅３３，表明它们的遗传相似程度低，遗传学差异大．Ｆ１‐５和Ｆ１‐７的ＧＳ值最大，为０畅９２，表明它们的遗传相似程度高，遗传学差异小，２者之间的亲缘关系较近．秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂与Ｆ１‐２的ＧＳ值为０畅５９，而与其他９个单株的ＧＳ值范围在０畅３３～０畅４０之间，表明Ｆ１‐２与 ＬＡ２８２３＂之间的差异比其他单株与 ＬＡ２８２３＂之间的差异小．上述结果说明尽管杂种来自共同双亲，但在后代个体之间出现了ＤＮＡ水平上的遗传分化．这种个体之间的差异为筛选新的育种材料提供了条件．若以供试材料抗青枯病的栽培番茄５６７８１６１＂为改良对象，在１０个单株中选择１个亲本进行回交，理论上应该选择Ｆ１‐２，因为它与秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂的亲缘关系较近，而与栽培番茄 ５６７８１６１＂的亲缘关系稍远． 根据ＳＲＡＰ标记数据计算材料间的遗传相似系数矩阵，采用ＮＴＳＹＳ软件计算材料间的遗传相似系数，并根据非加权成对算数平均数法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，建立了１２份材料的聚类树状图（图２）．以遗传相似系数０畅８４为阈值，１２份番茄材料可分成１个复合组和３８５２第３６卷 周国治，等：胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种个独立组．其中，第Ⅱ组为材料最多的复合组，含有Ｆ１代单株Ｆ１‐１、Ｆ１‐３、Ｆ１‐４、Ｆ１‐５、Ｆ１‐６、Ｆ１‐７、Ｆ１‐８、Ｆ１‐９和Ｆ１‐１０．第Ⅰ组、第Ⅲ组和第Ⅳ组是独立组，第Ⅰ组为栽培番茄 ５６７８１６１＂，第ＩＩＩ组为Ｆ１‐２，第Ⅳ组为秘鲁番茄ＬＡ２８２３＂．第Ⅱ组杂种材料作为栽培番茄５６７８１６１＂与秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂的杂交后代，单独作为一个分支聚在一起，显示了它们较近的亲缘关系，而杂交后代Ｆ１‐２独立于这个分支，表明Ｆ１‐２与其他杂交后代的亲缘关系比较远．图２ 基于ＳＲＡＰ标记的１２个供试材料的聚类图Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｏｆ１２ｍａｔｅｒｉａｌｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓ２畅４ 利用抗根结线虫基因的分子标记辅助抗性材料选择２畅４畅１ Ｍｉ‐１基因ＣＡＰＳ标记辅助选择 利用Ｍｉ‐１基因ＣＡＰＳ标记的正反引物对栽培番茄 ５６７８１６１＂、秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂及杂交后代进行ＰＣＲ扩增，然后利用限制性内切酶ＴａｑＩ对特异性扩增片段进行酶切．结果（图３）表明：双亲及杂种后代的特异片段被ＴａｑＩ酶切为２个片段，各片段的长度与预期结果一致；因此，栽培番茄 ５６７８１６１＂、秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂及１０个Ｆ１代单株均含有Ｍｉ‐１基因．２畅４畅２ Ｍｉ‐３基因ＳＣＡＲ标记辅助选择 利用Ｍｉ‐３基因ＳＣＡＲ标记的正反引物对栽培番茄 ５６７８１６１＂、秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂及杂交后代的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增．结果（图４）表明：在栽培番茄 ５６７８１６１＂和秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂的后代Ｆ１‐２单株中出现了约６００ｂｐ的ＳＣＡＲ标 Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ；１：栽培番茄５６７８１６１＂；２：秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂；（３～１２）：Ｆ１代单株（Ｆ１‐１～Ｆ１‐１０）．图３ Ｍｉ‐１基因的ＣＡＰＳ标记对５６７８１６１×ＬＡ２８２３及杂交后代的检测结果Ｆｉｇ．３ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ５６７８１６１×ＬＡ２８２３ａｎｄｉｔｓｐｒｏｇｅｎｉｅｓｗｉｔｈＣＡＰＳｍａｒｋｅｒｏｆＭｉ‐１ｇｅｎｅ记，而其他后代中没有扩增出６００ｂｐ的片段，由此表明Ｆ１‐２单株携带有抗根结线虫Ｍｉ‐３基因． Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ；１：栽培番茄５６７８１６１＂；２：秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂；（３～１２）：Ｆ１代单株（Ｆ１‐１～Ｆ１‐１０）．图４ Ｍｉ‐３基因的ＳＣＡＲ标记对５６７８１６１×ＬＡ２８２３及杂交后代的检测结果Ｆｉｇ．４ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ５６７８１６１×ＬＡ２８２３ａｎｄｉｔｓｐｒｏｇｅｎｉｅｓｗｉｔｈＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｏｆＭｉ‐３ｇｅｎｅ３ 讨 论 野生的秘鲁番茄与栽培番茄有性杂交时，由于种间杂交的不亲和性而引起幼胚停止发育和幼胚中途死亡，难以得到种间杂种．但秘鲁番茄是番茄抗病育种的主要抗源，为了达到对野生种有益基因资源挖掘利用的目的，吴定华等［１３‐１４］、Ｓｅｇｅｒｅｎ等［１５］和Ｔｈｏｍａｓ等［１６］以野生型番茄为父本、栽培种番茄为母本进行种间杂交，用杂种幼胚或未成熟种子组织培养获得杂种株．本试验中用杂种种子播种培养的杂种，９５２ 第３期浙江大学学报（农业与生命科学版）萌芽率为０．而利用组培技术对杂交幼胚进行组培，结果成功获得了１０个杂种胚培苗，有效地扩大了杂种群体，防止因杂种胚培苗的中途死亡而导致杂种的损失，目前已经获得１００多株胚培苗．研究表明幼胚组培是解决秘鲁番茄与栽培番茄种间杂交育种困难的有效途径． 利用分子标记对番茄杂种进行鉴定非常有效．于拴仓等［１７］利用ＲＡＰＤ、ＲＧＡ和ＳＲＡＰ技术对秘鲁番茄与栽培番茄的种间杂种进行了亲本鉴定，从而肯定了分子标记技术在番茄亲子鉴定中的有效性．本试验通过ＳＲＡＰ分子标记分析表明，秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂与Ｆ１‐２的ＧＳ值为０畅５９，而与其他９个单株的ＧＳ值范围在０畅３３～０畅４０之间；栽培番茄 ５６７８１６１＂与Ｆ１‐２的ＧＳ值为０畅７０，而与其他９个单株的ＧＳ值范围在０畅７９～０畅８５之间，结合聚类分析表明杂交后代Ｆ１‐２的遗传性受秘鲁番茄 ＬＡ２８２３＂的遗传影响稍强，其他９个杂交后代遗传性受栽培番茄 ５６７８１６１＂的遗传影响稍强．在番茄育种中，如果以优良的栽培番茄株系为改良对象，那么在１０个单株中选择１个亲本进行杂交，理论上应该选择Ｆ１‐２，因为它与秘鲁番茄ＬＡ２８２３＂的亲缘关系较近． 本研究利用Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３基因的特异引物对杂种植株进行分子检测，结果表明，１０个杂种后代中均含有Ｍｉ‐１基因，而同时拥有Ｍｉ‐１和Ｍｉ‐３基因的只有Ｆ１‐２，这也说明，非温敏型抗线虫基因Ｍｉ‐３的转育比较困难，迄今尚未见含有Ｍｉ‐３基因的栽培番茄商品种（系）育成．含有Ｍｉ‐３基因的Ｆ１‐２来自于直径约２ｍｍ的种子，生长势较弱，不易成活，而来自看似成熟种子的单株，生长势较强，易成活．含有Ｍｉ‐３基因的单株种子发育不好，生长势较弱的原因有待于进一步研究． 在番茄育种过程中，可以通过分子标记技术对所引进材料进行亲缘关系鉴定及杂交后代的早期鉴定，为杂交育种提供分子依据．本试验所用的亲本部分基因位点可能处于杂合状态，这样使得许多遗传信息未能进入种间杂种，限制了有益基因的转育效率；因而，有必要进行更大量的杂交，通过胚挽救获得更多的种间杂种植株，从而实现秘鲁番茄有益基因的有效转育．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：［１］ ＺＨＡＯＨｏｎｇ，ＰＥＮＧＤｅ‐ｌｉａｎｇ，ＺＨＵＪｉａｎ‐ｌａｎ（赵鸿，彭德良，朱建兰）畅Ｒｅｖｉｅｗｓｏｎｔｈｅｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｓ［Ｊ］畅ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（植物保护），２００３，２９（６）：６‐９．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２］ ＬＩＢａｏ‐ｊｕ（李宝聚）．Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ（中国蔬菜），２００６（１）：１‐５．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［３］ ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎＶＭ．Ｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｉｎｔｏｍａｔｏａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｆｕｔｕｒｅｕｓｅ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，３６：２７７‐２９３．［４］ ＡｍｍｉｒａｊｕＪＳ，ＶｅｒｅｍｉｓＪＣ，ＨｕａｎｇＸ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｈｅａｔ‐ｓｔａｂｌｅｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅＭｉ‐９ｆｒｏｍＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｓｈｏｒｔａｒｍｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ６［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０６：４７８‐４８４．［５］ ＹａｇｈｏｏｂｉＪ，ＫａｌｏｓｈｉａｎＩ，ＷｅｎＹ，ｅｔａｌ．ＭａｐｐｉｎｇａｎｅｗｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌｏｃｕｓｉｎＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，９１：４５７‐４６４．［６］ ＭＥＮＧＦａｎ‐ｊｕａｎ，ＬＩＪｉｎｇ‐ｆｕ，ＸＵＸｉａｎｇ‐ｙａｎｇ，ｅｔａｌ．（孟凡娟，李景富，许向阳，等）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｉｎｔｏｍａｔｏｇｅｎｅ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌｏｃｉ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ（分子植物育种），２００４，２（２）：２８７‐２９３．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［７］ ＣｈｅｎＬＺ，ＡｄａｃｈｉＴ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｂｏｒｔｉｏｎｏｆｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄｅｍｂｒｙｏｉｎｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｃｋｃｒｏｓｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ×（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ×Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）［Ｊ］．Ｃｙｔｏｌｏｇｉａ，１９９５，６０（２）：１２３‐１３１．［８］ ＤｏｇａｎｌａｒＳ，ＦｒａｒｙＡＳ，ＴａｎｋｓｌｅｙＳＤ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃＦ１ｈｙｂｒｉｄｓ，ＢＣ１，ＢＣ２ａｎｄＢＣ３ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍａｎｄｔｗｏａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍｃａｒｒｙｉｎｇｎｅｗｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９７，９５（２）：２０３‐２０７．［９］ ＺＨＡＯＨｏｎｇ，ＣＨＡＩＭｉｎ，ＹＵＳｈｕａｎ‐ｃａｎｇ，ｅｔａｌ．（赵泓，柴敏，于栓仓，等）．ＩｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃＦ１ｈｙｂｒｉｄｓｖｉａｏｖｕｌｅｃｕｌｔｕｒｅｂｅｔｗｅｅｎＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍａｎｄＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｅｄＭｉ‐３ｇｅｎｅ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ（分子植物育种），２００４，２（６）：８３３‐８３８．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［１０］ ＺＨＯＵＧｕｏ‐ｚｈｉ，ＹＥＱｉｎｇ‐ｊｉｎｇ，ＹＡＮＧＹｕｅ‐ｊｉａｎ，ｅｔａｌ．（周国治，叶青静，杨悦俭，等）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ‐ｇｅｎｅｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒｏｏｔ‐ｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅａｎｄｔｏｍａｔｏｌｅａｆｍｏｌｄｂｙＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（浙江大学学报：农业与生命科学版），２００８，３４（２）：１６３‐１６８．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）０６２第３６卷 周国治，等：胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种［１１］ ＮｅｉＭ，ＬｉＷＨ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｅｒｍｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９７９，７６：５２６９‐５２７３．［１２］ ＹａｇｈｏｏｂｉＪ，ＹａｔｅｓＪＬ，ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎＶＭ．ＦｉｎｅｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅＭｉ‐３ｉｎＳｏｌａｎｕｍｐｅｒｕｖｉａｎｕｍａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＤＮＡｃｏｎｔｉｇｓｐａｎｎｉｎｇｔｈｅｌｏｃｕｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００５，２７４：６０‐６９．［１３］ ＷＵＤｉｎｇ‐ｈｕａ（吴定华）．Ｆｕｒｔｈｅｒｎｏｔｅｓｏｎｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｅｓａｎｄｈｙｂｒｉｄｓｏｆｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ（园艺学报），１９８４，１１（１）：３５‐４１．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［１４］ ＷＵＤｉｎｇ‐ｈｕａ，ＬＩＡＮＧＳｈｕ‐ｎａｎ（吴定华，梁树南）．Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ（园艺学报），１９９２，１９（１）：４１‐４６．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［１５］ ＳｅｇｅｒｅｎＭＩ，ＳｏｎｄａｈｌＭＲ，ＳｉｑｕｅｉｒａＷＪ，ｅｔａｌ．Ｔｏｍａｔｏｂｒｅｅｄｉｎｇ：１．ｅｍｂｒｙｏｒｅｓｃｕｅｏｆｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｈｙｂｒｉｄｓｂｅｔｗｅｅｎＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ．ａｎｄＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（Ｌ．）Ｍｉｌｌ．［Ｊ］．ＲｅｖｉｓｔａＢｒａｓｉｌｅｉｒａｄｅＧｅｎéｔｉｃａ，１９９３，１６（２）：３６７‐３８０．［１６］ ＴｈｏｍａｓＢＲ，ＰｒａｔｔＤ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍａｎｄＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍｖｉａｅｍｂｒｙｏｃａｌｌｕｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９８１，５９（４）：２１５‐２１９．［１７］ ＹＵＳｈｕａｎ‐ｃａｎｇ，ＣＨＡＩＭｉｎ，ＺＨＡＯＨｏｎｇ，ｅｔａｌ．（于拴仓，柴敏，赵泓，等）．Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｙｂｒｉｄｆｒｏｍＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ×Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ（分子植物育种），２００５，３（１）：６１‐６５．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）欢迎订阅枟浙江大学学报（农业与生命科学版）枠枟浙江大学学报（农业与生命科学版）枠是浙江大学主办的全国性、综合性、学术性期刊．主要刊登农业基础科学和应用科学研究论文．内容涵盖农业和生命科学各个领域，包括作物遗传育种爛种质资源；植物保护；生理生态；作物栽培；土壤肥料；园艺；农产品的贮藏爛保鲜爛加工；畜牧爛兽医；以及生命科学方面的专论，研究论文，快讯等．读者对象主要是国内外农业科学研究人员，农业院校的教师和研究生，以及综合性大学等有关农业科学的研究与管理人员．本刊近年的影响因子、总被引频次两项重要指标均名列全国农业高校学术期刊的前列；２００１年入选中国期刊方阵；２００４年在教育部全国高校科技期刊评比中荣获壹等奖，全国优秀农业期刊评比壹等奖，２００５年又获第三届国家期刊奖百种重点期刊奖，２００６年再次荣获全国农业期刊评比壹等奖，首届中国高校优秀科技期刊奖；荣获中信所２００８年度 中国百种杰出学术期刊＂；现为全国综合性农业科学类核心期刊．目前被美国枟化学文摘枠（ＣＡ），美国枟剑桥科学文摘枠（ＣＳＡ），俄罗斯枟文摘杂志枠（ＡＪ），英国枟国际农业和生物科学中心文摘枠（ＣＡＢＩ），英国枟动物学记录枠（ＺＲ），联合国粮农组织ＦＡＯ枟农业索引枠（Ａｇｒｉｎｄｅｘ）及中国科学引文数据库，枟中国学术期刊文摘枠，中国期刊网枟中国学术期刊（光盘版）枠数据库，万方数据资源系统数字化期刊群数据库等国际国内重要检索系统收录．枟浙江大学学报（农业与生命科学版）枠为双月刊，Ａ４开本，１２０页，国内外公开发行．国内统一刊号：ＣＮ３３‐１２４７／Ｓ，国际标准刊号：ＩＳＳＮ１００８‐９２０９，邮发代号：３２‐４８，国外代号：ＢＭ４１０８．定价每期１０．００元／人民币，全年定价６０．００元／人民币．１６２ 第３期。
番茄抗番茄花叶病毒和斑点萎凋病毒病基因PCR标记的同时鉴定
番茄抗番茄花叶病毒和斑点萎凋病毒病基因PCR标记的同时鉴定陈丽静;李君明;宋燕;李天来;徐和金;周永健【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2004(037)007【摘要】利用同-PCR反应体系,对分别与番茄的抗番茄花叶病毒病的Tm22基因和抗斑点萎凋病毒病的Sw-5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合,其中与Tm22基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感试材均产生800 bp的特异片段,杂合抗病基因型和感病基因型有HindⅢ酶切位点,酶切结果为:纯合抗病RR:950 bp;杂合抗病Rr:950bp+500 bp+300 bp+150 bp;感病的rr:500 bp+300 bp+150 bp,纯合抗病基因型无HindⅢ酶切位点.与Sw-5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记,只有抗病试材扩增出400 bp的特异性片段.经反复验证,结果稳定、准确可靠,可用于在同一PCR反应体系中对2个抗病基因进行同时筛选鉴定.该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程.【总页数】5页(P982-986)【作者】陈丽静;李君明;宋燕;李天来;徐和金;周永健【作者单位】中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081;沈阳农业大学生物技术中心,沈阳,110161;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081;沈阳农业大学园艺学院,沈阳,110161;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】S6【相关文献】1.番茄种质抗黄化曲叶病毒病 Ty-1基因的分子标记分析与田间抗病评价 [J], 张前荣;朱海生;刘建汀;李永平;康建坂;王彬;李大忠;薛珠政;温庆放2.CAPS标记在番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty1和Ty3遗传关系分析上的应用 [J], 刘榛;张延安3.基于番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty-5CAPS的SNP标记开发 [J], 姚祝平;叶青静;王荣青;周国治;阮美颖;李志邈;万红建;杨悦俭4.番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子标记及检测 [J], 王涛;张子君;张逸鸣;王晓峰;邹庆道5.利用PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因 [J], 李君明;宋燕;徐和金;周永健;Carole Caranta;冯兰香因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄抗青枯病基因的AFLP分子标记
番茄抗青枯病基因的AFLP分子标记寿森炎;冯壮志;苗立祥;廖芳滨【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2006(28)2【摘要】用番茄高抗青枯病品种"T51A"与高感青枯病品种"T9230"配制杂交组合,接种鉴定其正反交F1代及F2代分离群体的青枯病发生情况.结果表明,T51A对青枯病的抗性属于细胞质遗传,受1对杂合基因加性控制.用64个EcoRⅠ/Mse Ⅰ引物组合对"T51A"、"T9230"两个亲本及其F2代抗病和感病基因池进行AFLP分析,共扩增出约4 200条可分辨的带,其中2条为稳定的差异.用"T51A"和"T9230"杂交产生的F2代分离群体对2个特异条带与目的基因的遗传连锁性进行分析,发现特异条带AAG/CAT与暂定名为RRS-342的抗青枯病基因紧密连锁,二者之间的遗传距离为6.7 cM.将AAG/CAT片段回收、克隆和测序,成功地将其转化为SCAR标记,可以更加方便地用于对番茄青枯病基因的标记辅助选择.【总页数】5页(P195-199)【作者】寿森炎;冯壮志;苗立祥;廖芳滨【作者单位】浙江大学园艺系,杭州,310029;浙江大学园艺系,杭州,310029;浙江大学园艺系,杭州,310029;浙江永隆山生物科技工程有限公司,诸暨,311800【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.青枯无致病力菌株诱导番茄抗青枯病的生化机制 [J], 陈庆河;翁启勇;胡方平2.番茄抗青枯病种质资源遗传多样性的AFLP分析 [J], 周国治;李志邈;杨悦俭;邢娟;王荣青3.番茄抗黄化曲叶病毒病基因的AFLP分子标记 [J], 姚金晓;杨悦俭;叶青静;王荣青;阮美颖;周国治;姚祝平4.番茄抗青枯病筛选方法及其在抗青枯病育种中的应用 [J], 王荣青;杨悦俭;周国治;阮美颖;姚祝平;叶青静5.抗感青枯病番茄的内生细菌数量动态分析及其对青枯病的生物防治 [J], 周岗泉;张秀冬;刘琼光;冯杭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄抗病种质资源分子标记筛选
番茄抗病种质资源分子标记筛选作者：杨再俊郑家瑞潘鹏程潘寅涛高彬李云洲来源：《山地农业生物学报》2021年第06期摘要：番茄是现代蔬菜的支柱产业，也是脱贫攻坚的优势产业，为了满足番茄生产种对抗病抗逆性的需求，挖掘利用抗病资源育种越来越被关注，本研究利用已明确的番茄根结线虫抗性基因Mi，抗PVY病毒病基因Pvr4，抗番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）基因Ty-1/Ty-3，对贵州本土16个番茄种质资源进行分子标记筛选。
结果表明：通过三对根结线虫抗性分子标记REXF1/REXR2、PM3Fb/PM3Rb和Mi23F/Mi23R对16个番茄种质资源进行检测，结果显示所有材料均含Mi基因，但是通过PMiF3/PMiR3对其检测，结果显示只有GZ09、GZ14、GZ10、GZ13等4个番茄材料含有Mi基因，而其他品种均不含Mi基因;另外，本研究通过Pvr4/Pvr7-F和Pvr4/Pvr7-R引物对16个番茄种质资源的马铃薯Y病毒（PVY）抗性分子标记进行检测，结果只有GZ04、GZ07和GZ06三个番茄材料含有Pvr4基因;用TYLCV抗性分子标记引物qR180/qF180扩增 16 个番茄材料，结果显示，GZ02、GZ19、GZ04、GZ07、GZ01、GZ08、GZ09、GZ03、GZ16、GZ05、GZ13、GZ18、GZ11等13个番茄品种含有抗性基因Ty1/Ty3。
综合分析三种抗病分子标记，确定GZ04、GZ07和GZ06为三个优异抗病材料，可用于将来的番茄抗病育种，本研究初步明确了贵州大学16个番茄种质资源的抗性分子標记，为番茄抗病育种提供材料选择，为贵州省‘红酸汤’产业奠定材料基础。
关键词：番茄;抗性基因;分子标记;种质资源中图分类号：S641.2文献标识码：A文章编号：1008-0457（2021）06-0030-07国际DOI编码：10.15958/ki.sdnyswxb.2021.06.004Abstract：Tomato is a pillar industry of modern vegetables and an advantageous industry for poverty alleviation.In order to meet the demand for disease and stress resistance in tomato production，more and more attention has been paid to the exploitation and utilization of resistance resources for breeding.This study used theresistance gene Mi of tomato root-knot nematode resistance gene Mi，the resistance gene Pvr4 of PVY virus disease，and resistance gene Ty-1/Ty-3 of tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）to identify the resistance molecular marker about 16 tomato germplasm resources from Guizhou.Sixteen tomato germplasm resources were tested by three pairs of root-knot nematode resistance molecular markers REXF1/REXR2，PM3Fb/PM3Rb andMi23F/Mi23R.The results showed that all materials contained Mi genes.When these materials were tested by PMiF3/PMiR3，the test results showed that only 4 tomato materials，such as GZ09，GZ14，GZ10，GZ13，contained Mi genes.In addition，this study used Pvr4/Pvr7-F and Pvr4/Pvr7-R primers to detect the potato virus Y（PVY）resistance molecular markers of 16 tomato germplasm resources.Only three tomato materials（GZ04，GZ07 and GZ06）contained Pvr4 gene.Sixteen tomato materials were amplified with TYLCV resistance molecular marker primerqR180/qF180.Thirteen tomato varieties contained the resistance gene Ty1/Ty3，such as GZ02，GZ19，GZ04，GZ07，GZ01，GZ08，GZ09，GZ03，GZ16，GZ05，GZ13，GZ18，GZ11，etc.GZ04，GZ07 and GZ06 were determined to be the excellent materials by comparing the three resistance molecular markers，which can be used for resistant breeding in tomato.This study has preliminarily clarified the resistance molecular markers of 16 tomato germplasm resources from Guizhou University，which provides material selection for tomato resistance breeding，and lays a material foundation for the "red and sour soup" industry in Guizhou Province.Keywords：tomato;resistance gene;molecular marker;germplasm resources番茄（Solanum lycopersicum L.），属于茄科（Solanaceae）蔬菜作物，因其经济价值高，已成为现代蔬菜的主导产业，更是脱贫攻坚的优势产业。
番茄果实光滑基因F的分子标记筛选及种质资源鉴定
番茄果实光滑基因F的分子标记筛选及种质资源鉴定许向阳;于亭亭;赵婷婷;李帅;姜景彬;张贺;李景富【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】以含F基因的果实光滑型品种12509为母本，以果实皱褶型品种12510为父本配制杂交组合，以亲本、F1及其F2代分离群体为研究材料，采用AFLP分子标记技术筛选与果实光滑基因F连锁的分子标记。
通过对256对AFLP引物进行筛选，获得6个与F基因连锁的标记：E13M08、E11M07-B、E11M12-D、E11M08-A、E01M10和E10M16-E，连锁遗传距离分别为6.4、8.5、10.9、17.1、23.5和24.2 cM。
将E13M08标记用于种质资源筛选，获得45份果实光滑型材料，为番茄外观品质育种奠定基础。
【总页数】6页(P32-37)【作者】许向阳;于亭亭;赵婷婷;李帅;姜景彬;张贺;李景富【作者单位】东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030;东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030【正文语种】中文【中图分类】S641.2【相关文献】1.番茄大花萼突变体MC基因的AFLP分子标记及种质资源筛选 [J], 李晓蕾;李景富;许向阳2.分子标记辅助筛选携带Xa23、Stvb-i、Pi-1抗病基因的水稻种质资源 [J], 孙海波;邹美智;任洪岩;王景余;李艳萍;冯瑞光3.与番茄抗叶霉病基因Cf-16连锁的分子标记筛选及种质资源鉴定 [J], 李宁;姚明华;王飞;许向阳;李景富4.大白菜抗根肿病基因 CRb 的分子标记验证与种质资源筛选 [J], 任平平;马安峰;程斐;孙朝辉;高建伟5.重庆加工型辣椒种质资源抗疫病鉴定的分子标记筛选 [J], 王春萍;杨小苗;李怡斐;雷开荣;黄启中;黄任中;林清;吴红;张世才因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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刘 蕾，王 辉，李文丽，等．与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ连锁的标记及应用［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１６）：９１－９３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１６．０２２
与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ连锁的标记及应用
刘 蕾，王 辉，李文丽，王 富（青岛农业大学园艺学院，山东青岛２６６１０９）
摘要：利用与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ紧密连锁的分子标记ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５在已知抗病材料和感病材料中进行验证，进而结合接种鉴定方法在抗病商品品种凯文Ｆ２代群体中加以应用。结果表明，ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５均为共显性标记，可以用于已知抗病和感病材料中的分子标记辅助鉴定；ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５在凯文Ｆ２代群体２４个单株中均检测到７个纯合抗病单株、５个感病单株和１２个杂合抗病单株；接种鉴定结果显示，有１个单株与分子鉴定结果存在出入，即分子标记辅助鉴定的准确率为９５．８３％。 关键词：番茄；颈腐根腐病；Ｆｒｌ基因；ＳＣＡＲ标记；ＣＡＰＳ标记 中图分类号：Ｓ４３６．４１２．１＋９ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１６－００９１－０３
收稿日期：２０１７－０２－２８基金项目：山东省现代农业产业技术体系（编号：ＳＤＡＩＴ－０５－０２）；山东省自然科学基金（编号：０１０ＣＭ０４７、ＺＲ２０１４ＣＱ０３４）；青岛农业大学高层次人才科研基金（编号：６６３－１１１５０４１）；山东省良种工程（编号：６６２－２３１７１８２）。作者简介：刘 蕾（１９９１—），女，山东临沂人，硕士，主要从事蔬菜遗传育种及生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｌｓｔａｒ６２４＠１２６．ｃｏｍ。通信作者：王 富，博士，教授，研究方向为蔬菜遗传育种及生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｆｕａｂｃｄ＠１６３．ｃｏｍ。
番茄颈腐根腐病（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔ，简称ＦＣＲＲ）于１９７４年首次在日本被发现［１］，之后于１９７６年在美国南部被发现［２］。目前此病害已对美国、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韩国以及欧洲等许多国家和地区的番茄生产造成重大损失［３－７］。最近几年，该病在我国华北、东北地区发病较重，其中山东省最早于２０１０年在寿光市发现该病，随后逐渐蔓延至全省各地。当前，此病害已经严重威胁到山东省温室大棚冬春季番茄生产［８］。引发番茄颈腐根腐病的病原菌主要是尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｒａｄｉｃｉｓ－ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ，简称ＦＯＲＬ），此病侵染周期相对较长，番茄一旦感染，目前还没有十分安全有效的治疗方法［９］，所以对于该病害最科学的防治方法就是选育抗番茄颈腐根腐病的新品种。已有研究结果表明，番茄颈腐根腐病抗病性遗传是由显性单基因Ｆｒｌ控制的［１０］，并且３份抗源材料中的抗病基因均为同一种基因［１１］，３份番茄颈腐根腐病抗源材料都是源自野生番茄Ｓｏｌａｎｕｍｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＰＩ１２６９４４、ＰＩ１２８６５０和ＰＩ１２６９２６），已有研究者将其中的抗病基因转入栽培番茄中［１２］，抗病基因Ｆｒｌ已被定位到９号染色体上［１０，１３］。本研究利用与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ连锁的分子标记ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５在已知抗病和感病材料中进行验证［１４－１５］，进而在Ｆ１代抗病材料自交后代群体中进行分子标记辅助筛选，结合接种鉴定结果评价该标记的应用价值。
１ 材料与方法１．１ 材料本研究所用试验材料包括已知抗病材料Ｐ１、感病材料Ｐ２
及其杂交１代，抗病Ｆ１代商品品种凯文及Ｆ２代群体材料共
２４株（分别编号为１～２４）。１．２ 方法１．２．１ 番茄样品ＤＮＡ的提取纯化及检测 采用十六烷基三甲基溴化铵（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，简称ＣＴＡＢ）法提取试验材料的ＤＮＡ并进行纯化，设计出合适的引
—１９—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１６期物对番茄材料ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳及成像技术显示ＤＮＡ条带并观察分析。１．２．２ 引物合成 与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ紧密连锁的共显性ＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，即酶切扩增多态性序列）标记Ｃ２－２５由Ｓｔａｎｉａｓｚｅｋ等设计［１４］，ＳＣＡＲ２００由Ｍｕｔｌｕ等设计［１５］。引物序列交给生工生物工程（上海）股份有限公司协助合成。１．２．３ ＰＣＲ扩增反应 ＰＣＲ反应体系：模板ＤＮＡ（２０～８０ｎｇ／μＬ）４．０μＬ，１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）２．０μＬ，引物Ｆ／Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ，Ｔａｑ酶（２．５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／μＬ）２．５μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ补足至２０μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，６０℃退火４０ｓ（ＳＣＡＲ２００）或５７℃退火４０ｓ（Ｃ２－２５），７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存。取ＰＣＲ扩增产物约１０μＬ，在２％琼脂糖凝胶电泳上检测ＰＣＲ扩增结果，用自动凝胶成像系统观察照相，记录电泳结果。１．２．４ 酶切方法 使用限制性内切酶ＸａｐⅠ在３７℃下将扩增产物酶切３ｈ，酶切反应体系：ＰＣＲ产物５．０μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ１．５μＬ、ＸａｐⅠ０．３μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ补足至１５μＬ。３７℃酶切２ｈ，取酶切产物５μＬ经２％琼脂糖凝胶电泳检测，用自动凝胶成像系统观察照相，记录结果。１．２．５ 番茄抗病材料的接种鉴定 将病原菌进行摇菌培养，２５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡５ｄ，用３层纱布过滤除去菌丝并离心收集沉淀，将沉淀稀释成１０７个／ｍＬ，将生长至１张真叶期的番茄根洗净并将主根剪出伤口，浸泡在孢子悬浮液中１５ｍｉｎ，并设置感病材料作为对照，置于１８℃光照培养箱中培养，２周后观察发病症状。２ 结果与分析２．１ ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５在Ｐ１、Ｐ２、Ｆ１代及凯文中的验证选用与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ紧密连锁的分子标记ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５，分别在抗病材料Ｐ１、感病材料Ｐ２、Ｆ１代及商品种凯文中进行ＰＣＲ检测。由图１、图２可知，ＳＣＡＲ２００在抗病材料Ｐ１中可扩增出２９０ｂｐ左右的特异ＤＮＡ条带，在感病材料Ｐ２中可扩增出３１０ｂｐ的目的条带，在Ｆ１代和凯文中均可扩增出２９０、３１０ｂｐ２条特征谱带，可见ＳＣＡＲ２００为共显性标记，可用于已知抗、感材料的分子标记辅助鉴定。ＣＡＰＳ标记Ｃ２－２５在抗病材料Ｐ１中的酶切产物存在７００ｂｐ左右的特异ＤＮＡ条带，在感病材料Ｐ２中的酶切产物存在１０００ｂｐ的目的条带，在Ｆ１代和凯文中均同时存在７００、１０００ｂｐ２条特征谱带，可见该标记可以用于已知抗、感材料的分子标记辅助鉴定。２．２ ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５在凯文Ｆ２代群体单株中的检测对与番茄颈腐根腐病抗病基因Ｆｒｌ紧密连锁的分子标记ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５分别在凯文Ｆ２代群体中进行分子检测，由图３、图４可知，Ｆ２代群体２４个单株中有７个单株（编号分别为１、１３、１５、１７、１９、２０、２１）在ＳＣＡＲ２００和Ｃ２－２５检测中为纯合抗病单株；有５个单株（编号分别为５、１０、１２、１６、２２）为感病单株；其余１２个单株（编号分别为２、３、４、６、７、８、９、１１、１４、１８、２３、２４）为杂合抗病单株。
２．３ 凯文Ｆ２代群体抗病接种鉴定结果对２４份未知抗病性的番茄单株进行人工接种颈腐根腐病病原菌鉴定，由表１可知，６个单株（编号分别为５、１０、１２、１６、２２、２４）表现为感病，主根和茎基部都出现萎缩变褐现象，并且株高较小，根的长度也明显短于未发病植株；其他植株根和茎基部均表现正常，表现为抗病。 图３、图４的分子标记检测结果显示，有５个单株（编号分别为５、１０、１２、１６、２２）为感病单株，与接种鉴定结果相比，仅有１个单株（编号为２４）在分子鉴定过程中显示为抗病，而在接种鉴定结果中显示为感病，可见分子标记鉴定结果的准确率为９５．８３％。