多管发酵法步骤和材料清单
实验十一 多管发酵法测定水中大肠菌群PPT教学课件
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三、实验材料
1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍
浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套 管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪器或其他用具：
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭 菌试管等。
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四、操作步骤
1．水样的采取 实验室提供水样 2．河水的检查 （1）初（步）发酵实验
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二、实验原理
发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法
1) 初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳
糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经 37 ºC培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内 加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后， 培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判 断是否有大肠菌群存在。
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引 起糖类发酵，因此需要进一步证实。
将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美 兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带 核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可 能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进 一步证实是否为大肠菌群。
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10ml×100 1ml×100 1ml×10-1 1ml×10-2
3×
1×
1支
1×
1×
各3支
图1 2020/12/10 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释 11
PPT教学课件
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水样的稀释： 10-1与10-2
总大肠菌群多管发酵法测定步骤
总大肠菌群多管发酵法测定步骤# 总大肠菌群多管发酵法测定步骤的理论研究大家好，我是这个领域的一名专家。
今天我要和大家分享一下关于总大肠菌群多管发酵法测定步骤的一些理论问题。
我们要知道什么是总大肠菌群。
简单来说，总大肠菌群就是肠道里的一种微生物群落，它们的数量可以反映出一个人是否健康。
而测定总大肠菌群的方法有很多种，其中最常用也最准确的一种是多管发酵法。
那么，多管发酵法是怎么测定总大肠菌群的呢？简单来说，就是将待测样品中的总大肠菌群接种到不同的培养基上进行培养，然后通过观察不同培养基上的菌落生长情况来判断总大肠菌群的数量。
在实际操作中，我们需要准备几个不同的培养基，每个培养基上都涂上一层薄薄的液体。
然后将待测样品中的总大肠菌群接种到这些培养基上，再将这些培养基放入恒温箱中进行培养。
在这个过程中，我们需要注意一些细节。
比如，培养的时间需要控制好，不能太长也不能太短；培养的温度也需要控制好，不能太高也不能太低；还有，培养基的选择也很重要，要选择适合总大肠菌群生长的培养基。
经过一段时间的培养后，我们就可以观察各个培养基上的菌落生长情况了。
一般来说，如果某个培养基上的菌落数量较多，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较多；反之，如果某个培养基上的菌落数量较少，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较少。
我们就可以根据各个培养基上的菌落生长情况来计算出总大肠菌群的数量了。
这就是多管发酵法测定总大肠菌群的基本步骤。
总的来说，多管发酵法是一种非常准确、可靠的测定总大肠菌群的方法。
它的操作过程虽然复杂了一些，但是只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能够准确地测定出样品中总大肠菌群的数量。
这对于我们了解肠道微生物群落的情况、预防肠道疾病等方面都有着重要的意义。
实验九 多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查表3 ▲ 将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
大肠菌群
二 基本原理
多管发酵法包括三个部分
▲ 初发酵试验 ▲ 平板分离 ▲ 复发酵试验
1 初发酵实验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。 乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群 能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基 内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来 的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的 作用。 水样接种于发酵管内，37℃下培养： （1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变 ，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； （2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应 视为可疑结果。
（1） 稀释水样：原水样 10-1
10-2
（2） 初步发酵试验
——接种水样
混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
水样稀释及接种
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。
在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。
笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。
关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。
在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。
不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。
按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。
而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。
初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。
在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。
1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断：分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。
多管发酵法测定水中大肠菌群
综合实验报告书（2014~2015 学年）实验题目多管发酵法总测定水中大肠菌群学院名称生物与食品工程学院专业（班级）2012级生物工程姓名（学号）孙大林20122151032015年01 月13日多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：利用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量，以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验，得出水样中总大肠菌群数，实验结果以最大可能数MPN表示。
关键词：多管发酵法、大肠菌群、最大可能数（MPN）Abstract: the use of multiple tube fermentation test of tap water and the number of coliform group, pond water in different water samples of coliform bacteria pollution make a preliminary judgment.According to "the People's Republic of China national drinking water standard inspection » in the fecal coliform detection method and index of the water samples fortesting.Tube by a positive record number (MPN) maximum possible log tables and check of coliform bacteria may content in different water samples.Multi-tube fermentation principle is based on fecal coliform bacteria can ferment lactose produce acid gas and possess a gram negative, no spore, assumes the rods and so on characteristics, through the early (step) fermentation test, plate separation and the complex fermentation test three steps of the experiment, it is concluded that the total number of coliform bacteria in water samples, the experimental results with the greatest possible number of MPN said.Key words: multi-tube fermentation coliform groupthe greatest possible number (MPN)由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
生化培养箱多管发酵法注意事项
生化培养箱多管发酵法注意事项1．样品的保存采样用的容器使用前应盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好，置干燥箱160℃-170℃干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。
采样后水样的正确保存也很重要，如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长，这些都将影响检测结果的准确性。
检测室接到水样后，应立即检测，如因故不能检测时，应立即将样品置于冰箱内(2℃-10℃)并于2小时内检测。
2．培养温度的要求总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44．5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44．5℃仍可继续生长。
因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分，两种方法也都基于此理。
将接种好的样品或装有滤膜的培养基放入生化培养箱时，箱内温度一定要达到所要求的温度(44.5±0.5℃)时，方可放入。
如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。
3．加氯水样的处理经氯处理消毒过的水样，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应提前在采样瓶中加硫代硫酸钠，硫代硫酸钠可以脱氯，使受损的细菌得以复苏与修复，从而避免出现计数结果偏低甚至假阴性的现象。
此外余氯对滤膜法培养的细菌其抑制作用尤为明显，所以抽滤时应对水样进行大量无菌水稀释，以减少余氯的残留。
4．培养物质的制备与保存⑴.多管发酵法所使用的培养液在分装于各发酵管中后，应将发酵管尽快放于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min(注意：这个温度也应控制好，既达到灭菌的作用，还要防止培养物质分解流失)，然后贮存于冰箱或暗处备用。
⑵.滤膜法所采用的M-FC培养基多使用外购的成品，培养基中苯胺蓝的纯度和质量往往影响菌落的颜色，因此，无菌包装的成套培养基在使用前，最好先接种典型粪大肠菌，以观察对比菌落的颜色，来鉴定其稳定性。
Binder生化培养箱在多管发酵法的应用
Binder生化培养箱在多管发酵法的应用1．多管发酵法初发酵实验发酵管内装有单倍或三倍乳糖蛋白胨培养液，并在内倒置有小玻璃管。
培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。
产酸产气的发酵管表明试验阳性，如在倒管内产气不明显，可轻拍发酵管，有小气泡升起为阳性。
复发酵实验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环将培养物（2-3环）转接到EC培养液中，在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h（提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长）。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
2．滤膜法滤膜是一种微孔性滤膜，孔径0.45μm。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的过滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h。
粪大肠菌群菌落在M-FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落成灰色、淡黄色或无色。
正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在M-FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。
二．两种方法的注意事项1．培养温度的要求总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44．5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44．5℃仍可继续生长。
因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分，两种方法也都基于此理。
将接种好的样品或装有滤膜的培养基放入生化培养箱时，箱内温度一定要达到所要求的温度（44.5±0.5℃）时，方可放入。
如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。
2．加氯水样的处理经氯处理消毒过的水样，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应提前在采样瓶中加硫代硫酸钠，硫代硫酸钠可以脱氯，使受损的细菌得以复苏与修复，从而避免出现计数结果偏低甚至假阴性的现象。
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多管发酵法测定大肠杆菌一、实验器材及药品：
二、实验步骤
2.1 水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一接种水样量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
使用的水样量可参考下表1。
表1 接种用水量参考表
如接种体积为10ml则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml;如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
2.2 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24h±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
2.3 复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
三、结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2 或表3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。
接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表2 可得每升水样中的粪大肠菌群；
接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。
如果接种的水样不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3 求得MPN 值，再经下式计算成每100mL 的MPN 值。
附：（两种培养基也可以直接购买）
单倍乳糖蛋白胨培养液成分；10g蛋白胨，3g牛肉浸膏，5g乳糖，5g氯化钠， 1.6%溴甲
酚紫乙醇溶液1ml，1000ml蒸馏水。
配置时调节pH：7.2—7.
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EC培养液成分：20g胰胨，5g乳糖，1.5g胆盐三号，4g磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，5g 氯化钠，1000ml蒸馏水。
灭菌后pH为6.9.。