一种快速、 便提取大豆油 DNA 的方法及转基因大豆油的检测 简

摘要：【目的】DNA 的提取是 GMO（Genetically modified organism）作物检测中重要步骤，DNA 的质量关 系到 GMO 检测的成败。【方法】本研究以大豆油为材料，探索出一种快速、简便的提取大豆油 DNA 的方法。【结 果】该方法能从 10 ml 大豆油中提取 0.4 μg 高纯度 DNA，可用于 PCR 检测。提取市场上出售的十几种精练大豆 油的 DNA, 针对 35S、Nos、EPSPS 和 Lectin 基因进行了 PCR 检测，分别扩增出不同的目的片段。【结论】大豆 油中有残存的 DNA 碎片，在转基因大豆油中能扩增出外源基因的片段。本研究为大豆油的外源基因的检测提供了 可行方法。
min，（94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s）×35 个循环， 72℃10 min。
2 结果与分析
2.1 大豆油 DNA 的提取方法 目前国内外的 GMO 提取试剂盒都不能从油中提
取 DNA，本研究经反复试验，开发出离心柱法提取精 炼大豆油 DNA 的试剂盒，已从 10 ml 油中提取出 0.4 μg DNA。人工手提法也能在 500 ml 油中提取 0.4 μg DNA。
1 材料与方法
1.1 材料 市售的大豆色拉油，品牌有：北鹰（2001-5-15）、
红 灯 （ 2001-7-12 ） 、 金 龙 鱼 （ 2001-6-12 ） 、 元 宝
（2001-9-3）、火鸟（2001-10-9）、绿宝（2001-8-4）、 四海（2001-8-27）、福临门（2001-7-11）、大满贯 （2001-7-19）、贝特力（2001-7-27）。中昌转基因大 豆油作为阳性对照。 1.2 试剂
收稿日期：2005-10-20；接受日期：2006-11-28 基金项目：国家“863”计划资助项目 2001AA212311 和 2004AA212222 作者简介：程红梅（1967-）,女，河南信阳人，研究员，博士，研究方向为棉花抗病基因工程及转基因生物安全性研究。Tel:010-62130148；010-
图 1 显示 Monsanto 公司转基因抗草甘膦大豆中转 基因质粒图谱。引物由上海生工生物工程有限公司合 成，其核苷酸序列和扩增片段长度见表 1。 1.4 PCR 反应条件
P-FMV
CTP1
CP4-EPSPS
NOS
KAN
NOS
CP4-EPSPS
CTP4
P-e35S
GUS
图 1 Monsanto 公司用于转化大豆的抗草甘膦基因的质粒图谱 Fig. 1 Plasmid map contained glyphosate-resistant gene introduced into soybean by Mosanto company
转基因作物及其产品已大量进入到人们的日常生活 中。【前人研究进展】由于对转基因作物及其产品安 全性的关注及国际贸易等问题，世界许多国家纷纷出 台了严格的管理法规，欧盟、日本、韩国、台湾等国 家和地区的转基因产品的标签制度，明确要求食品中 超过 1%或 5%含量的转基因成分必须实施标签。在中 国，由于检测技术和设备落后，国外大量转基因产品 在毫不知情的情况下涌入国内，尤其是国内企业在商 业利益的驱动下，利用转基因原料生产食品。如 2000 年中国进口大豆 1 040 万吨，其中大部分为转基因大
Abstract: 【Objective】DNA extraction is an important step in GMC (Genetically modified crop) detection. 【Method】In this paper we have developed a simple and rapid- method for extraction of DNA from soybean oil. 【Result】A yield of 0.4 μg NA/10 ml oil can be obtained. PCR amplification of sequences of 35S, Nos, EPSPs and an endogenous reference gene lectin in 11 market available brand of refined soybean oil was performed. Results showed that the sequence-specific fragments were amplified in all of the samples, demonstrating that the method could be applied for detection of transgene sequences in refined soybean oil. 【Conclusion】There are some DNA fragments in soybean oil, and PCR amplification can detect the foreign DNA. This research provide a method to isolate and detect the foreign DNA in soybean oil.
5′ ATCTgCAgTCCATTgTTAgAgATAgATTTgTAgAgAg 3′
EPSPS
5′ CCTTCATgTTCggCggTCTCg 3′ 5′ gCgTCATgATCggCTCgATg 3′
Nos
5′ TTA AgA TTg AAT CCT gTT gCC g 3′
5′ TAA TTT ATC CTA gTT TgC gCg C 3′
中国农业科学 2007,40(5):1069-1072 Scientia Agricultura Sinica
一种快速、简便提取大豆油 DNA 的方法及转基因大豆油的检测
程红梅 1，彭于发 2，金芜军 1，贾士荣 1
（1 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100094）
表 1 35S、EPSPS 和 Nos 基因的引物及产物大小
Table 1 List of different specific primer and the size of their product
基因
引物序列
Gene
Primer sequence
35S
5′ CgCAAgCTTgATATCATggTggAgCACgACACTC 3′
62133685；E-mail:chenghm@
1070
中国农业科学
40 卷
豆，对国产大豆生产造成巨大冲击。中国也于 2002 年 5 月公布了转基因农产品的标识规定，并于 2003 年 3 月 20 起正式实施[2, 3]。【本研究的切入点】转基 因大豆及其制品实施标识管理，由于大豆油成分特殊， 目前国内尚缺乏检测试剂盒和相关的规范研究。【拟 解决的关键问题】针对以上情况，本研究以大豆油为 材料，探索出一种快速、简便的提取大豆油 DNA 的 方法，并提取市场上出售的十几种精炼大豆油的 DNA, 针对 35S、Nos 和 Epsps 等外源基因和内源基因 Lectin 进行了 PCR 检测，可以为检测部门提供评判标准。
(1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094)
Key words: Soybean oil; Transgenic soybean; Detection method; DNA extraction; PCR
0 引言
【研究意义】20 世纪 80 年代世界上第一例转基 因植物诞生以来，到 2000 年，转基因作物种植面积已 达 4 420 万公顷，比 1999 的 3990 万公顷增加 11%， 1996～2000 的 5 年间增长 25 倍。美国种植了 3 030 万公顷、阿根廷种植了 1 000 万公顷、加拿大 300 万 公顷、中国 50 万公顷。转基因大豆种植发展最快， 2003 年全球有 4 140 万顷，2004 年达到 5022 万顷， 2005 年 6370 万顷（占全球转基因作物面积的 71%）[1]。
关键词：大豆油；转基因大豆；检测方法；DNA 提取；PCR
A Simple and Rapid Method for Isolation of DNA from and Detection of Transgene Sequences in Soybean Oil
CHENG Hong-mei1, PENG Yu-fa2, JIN Wu-jun 1, JIA Shi-rong1
自制的大豆油提取试剂盒。Taq DNA 聚合酶及其 缓冲液购自华美公司，dNTPs 购自 Promega 公司。其 余均为国产分析纯试剂。PBS 缓冲溶液：NaCl（138 mmol·L-1），KC（l 2.7 mmol·L-1），Na2HPO（4 10 mmol·L-1）, NaH2PO4（1.8 mmol·L-1）。 1.3 PCR 引物
Lectin
5′ GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3′ 5′ GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3′
产物片段大小 Amplified fragment(bp)
500493192源自118PCR 反应体系为 50 μl，模板 DNA 为 1～100 ng， PCR 反应缓冲液终浓度为 50 mmol·L-1 KCl，10 m mol·L-1 Tris-Cl （pH 8.3），2～4 mmol·L-1 MgCl2，0.2 mmol·L-1 dNTP，0.1 μmol·L-1 引物，1～2 U Taq DNA 聚合酶。EPSPS 引物反应条件：95℃3 min，（94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min) ×35 个循环，72℃10 min。 35S 引物反应条件：95℃3 min，（94℃1min，53℃1 min， 72℃1 min）×35 个循环，72℃10 min。NOS 引物反应 条件：95℃3 min，（94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min） ×35 个循环，72℃10 min。Lectin 引物反应条件：95℃2