核酸提取原理及常见问题
核酸的提取经验及原理总结
一、核酸核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。
一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。
今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。
一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。
核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。
他当时称之为核素。
阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。
二、核酸的分类和功能核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。
这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。
碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。
DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。
核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。
三、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。
四、细胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。
核酸提取经验及原理总结
核酸提取经验及原理总结核酸提取是分子生物学研究中的一项重要技术，它可以从生物样品中分离和纯化出目标的核酸分子，为后续的实验操作提供基础。
本文将对核酸提取的经验和原理进行总结，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
核酸提取的经验总结：2.样品的预处理：在核酸提取前，需要对样品进行一些预处理，如细胞裂解、组织破碎等。
这些步骤有助于释放和保护核酸分子，促进提取效果。
3.溶解和裂解：核酸提取的第一步是将样品溶解和裂解，以释放核酸分子。
溶解缓冲液常用于裂解样品，并加入蛋白酶进行蛋白质降解。
此时需要考虑样品的特性和实验要求，选择合适的裂解缓冲液和裂解方法。
4.核酸分离：核酸分离是核酸提取的关键步骤，常用的分离方法有酚-氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
在选择分离方法时需考虑样品的类型和实验要求，以及各种方法的特点和优势。
5.纯化和浓缩：提取的核酸分子中常含有杂质，需要进行纯化和浓缩。
常用的纯化方法有酚-氯仿法、琼脂糖凝胶电泳法和商用纯化试剂盒等。
纯化后的核酸可以进行浓缩，以提高其浓度和纯度。
6.质量检测：核酸提取后，需要对提取的核酸分子进行质量检测。
常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、比色法和荧光分析等。
通过检测可以了解核酸的浓度、纯度和完整性，为后续实验提供准确的数据。
核酸提取的原理总结：1.细胞裂解和溶解：细胞裂解是将细胞壁和细胞膜破坏，使细胞内容物暴露在溶液中。
细胞溶解液中常含有裂解缓冲液和蛋白酶等物质，以促进细胞的裂解和蛋白质的降解。
2.核酸分离和纯化：核酸在细胞溶解液中可以与其他细胞成分分离，常用的方法有酚-氯仿法。
酚可溶于水，而氯仿可溶于有机溶剂，通过两相溶剂的分层，可以将核酸沉淀到有机相中，从而实现核酸的分离。
3.杂质去除和浓缩：通过纯化方法，可以将核酸与其他杂质分离。
如硅胶柱和磁珠法通过静电吸附和洗脱来除去杂质，商用纯化试剂盒则通过离心柱等固相材料来实现。
纯化后的核酸可以进行浓缩，以提高其浓度和纯度。
4.质量检测：核酸提取后，需要对提取的核酸进行质量检测。
吸附柱法提取核酸的原理及基本流程
吸附柱法提取核酸的原理及基本流程今天来跟大家唠唠吸附柱法提取核酸这回事儿。
一、吸附柱法提取核酸的原理。
咱先说说这原理哈。
核酸它是个很神奇的东西，吸附柱法提取它呢，就像是给核酸找了个特别的“小窝”。
这里面有个关键的东西叫吸附柱，这个柱子里面的材料对核酸有着特殊的亲和力。
你可以把核酸想象成一个个可爱的小磁铁，而吸附柱里的东西就像是能吸引这些小磁铁的特制金属。
在特定的溶液环境下，核酸就会乖乖地被吸附到柱子上。
这里的溶液环境很重要哦，就像给小磁铁和特制金属创造了一个合适的约会场景一样。
一般来说，溶液里会有一些盐离子之类的东西，它们就像是红娘，帮助核酸和吸附柱更好地结合。
而且呢，其他的杂质在这个环境下就不会像核酸这么“积极”地往柱子上跑啦，这样就初步实现了核酸和杂质的分离。
二、吸附柱法提取核酸的基本流程。
1. 样本的准备。
咱开始提取核酸之前，得先把样本准备好呀。
这样本可以是各种各样的，像血液啊、组织啊之类的。
如果是血液样本，得先处理一下，把血细胞之类的东西弄好，让核酸能方便地被提取出来。
这就好比是要从一堆宝藏里找宝贝，得先把宝藏周围的石头啊土啊啥的稍微清理一下。
对于组织样本呢，可能要把组织捣碎，让细胞都释放出来，这样核酸才不会被藏得太深。
这一步就像是打开宝藏的大门，让里面的宝贝都露出来。
2. 裂解细胞。
样本准备好了，接下来就是裂解细胞啦。
这一步就像是把装着核酸的小盒子给打破，让核酸能自由活动。
我们会用到一种裂解液，这个裂解液就像是一把万能钥匙，它能把细胞的膜啊什么的给破坏掉。
细胞一被裂解，里面的核酸就都跑出来啦，就像一群小精灵从被打破的笼子里飞出来一样。
而且这个裂解液还能让核酸在溶液里保持稳定，不会突然就消失不见或者被破坏掉。
3. 核酸结合到吸附柱上。
细胞裂解了，核酸都出来了，这时候就轮到吸附柱登场啦。
把裂解后的样本溶液加到吸附柱里，就像把一群小动物赶到它们的小窝里一样。
在前面提到的那种合适的溶液环境下，核酸就会紧紧地吸附在吸附柱上，而那些杂质呢，就还在溶液里晃悠，这时候就初步把核酸和杂质分开啦，是不是很神奇呢？4. 清洗吸附柱。
核酸提取技术的原理和应用
核酸提取技术的原理和应用介绍核酸提取技术是生物学研究和临床实验中常用的一种实验方法。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、病理学等领域，为研究人类疾病的发生机制以及改进治疗方法提供了重要的方法支持。
本文将介绍核酸提取技术的原理以及在不同领域的应用。
核酸提取技术的原理核酸提取技术旨在从生物样本中提取纯净的核酸（包括DNA和RNA），以便进行后续的实验操作。
其基本原理如下：1.细胞破裂：首先需要将生物样本中的细胞破裂，以释放细胞内的核酸。
这可以通过物理、化学或者生物学方法实现。
常用的方法包括冻融法、酶切法、声波破碎法等。
2.蛋白质去除：提取到的核酸常常伴随有大量的蛋白质、碳水化合物、脂质等杂质。
因此，为了得到纯净的核酸，需要使用蛋白酶或化学试剂去除这些杂质。
常用的方法有酚-氯仿法、硅胶柱法等。
3.核酸沉淀：通过适当的条件，如加入盐、有机溶剂或乙醇，可以使核酸从溶液中沉淀出来。
核酸沉淀的条件可根据所用的核酸类型（DNA还是RNA）进行调整。
4.质量检测：在提取核酸后，为了确认提取到的核酸质量和纯度，通常需要进行质量检测。
这可以通过比色法、吸光度测定、凝胶电泳等方法实现。
核酸提取技术的应用核酸提取技术在不同领域都有广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：基因组学研究•DNA测序：核酸提取是进行DNA测序的前提，测序结果可以帮助研究人员深入了解生物的基因组结构和功能。
•基因表达研究：通过提取RNA并转录为cDNA，可以分析基因的表达水平，进而了解不同细胞状态或组织中基因的表达差异。
遗传学研究•遗传疾病研究：核酸提取技术可以帮助研究人员分析与遗传疾病有关的基因变异，揭示疾病的发生机制。
•个体鉴定：通过核酸提取和DNA指纹技术的结合，可以进行个体鉴定，如刑事侦查中的DNA比对。
病理学研究•癌症诊断：通过提取癌细胞中的核酸，可以进行基因突变的检测，从而帮助癌症的早期诊断和治疗方法选择。
•感染病原体检测：核酸提取技术可以用于检测病原体的核酸，如病毒、细菌等，有助于早期发现和诊断传染病。
DNA提取注意事项
核酸制备中常用的酶
DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
一、实验原理
-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 问题三：DNA提取量少 四、注意事项——细胞裂解 使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 ②所有器皿要严格消毒，
五、DNA4提取、常见核问题酸制备的一般方法和原理
破碎细胞或包膜－内容物释放 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.
3、核酸制备的一般原则
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备的步骤：
破碎细胞 提取 纯化
II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质
1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
核酸提取的一般过程 3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污 染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
保存介质：
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。
磁珠提取核酸的基本原理
磁珠提取核酸的基本原理磁珠提取核酸是一种常见的核酸提取方法，基于磁性珠颗粒在外磁场的作用下对核酸的选择性结合和释放。
这种方法具有高度自动化、高通量、操作简便等优势，广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因组学研究等领域。
以下是磁珠提取核酸的基本原理：1.磁性珠的修饰：磁性珠表面通常被修饰成能够与核酸高效结合的功能基团，比如硅胶、硅氧烷等。
这些功能基团能够与核酸中的磷酸基团或亲和基团发生相互作用。
2.样品裂解：样品（比如细胞、组织或血清）首先需要经过裂解步骤，以释放内部的核酸。
这一步通常涉及到蛋白酶的使用，以去除蛋白质的保护，使核酸暴露出来。
3.磁珠的加入：经过裂解的样品中加入磁性珠。
磁性珠在外磁场的作用下，可以被导向到样品中。
4.核酸结合：磁性珠表面的功能基团与核酸发生特异性结合，形成核酸-磁珠复合物。
这一步通常涉及到一系列缓冲液和混合步骤，以保证核酸充分结合到磁性珠上。
5.洗涤：通过洗涤步骤，去除非特异性吸附在磁珠表面的杂质，提高提取的纯度。
6.磁场分离：在外磁场的作用下，磁性珠与核酸结合的复合物被导向到一侧，而未结合的杂质则在另一侧。
这样可以实现核酸与杂质的分离。
7.洗脱：通过改变缓冲液条件，破坏核酸与磁珠之间的结合，使核酸从磁性珠上洗脱下来。
这一步可以在离心机中进行，也可以在特定的温度下进行。
8.收集核酸：最后，收集洗脱后的核酸溶液，用于后续的分析或实验。
总体来说，磁珠提取核酸的原理是通过磁性珠在外磁场的作用下对核酸的特异性结合和释放，实现核酸的纯化和提取。
这一方法的优势在于其高度自动化和适应于高通量实验。
核酸提取原理及的方法
核酸提取原理及的方法核酸提取是生物学研究中常用的一项操作技术，用于从生物样本中提取出纯度较高的核酸物质，以供进一步的分析和实验使用。
核酸提取的原理是将细胞膜破裂，使得核酸释放到溶液中，然后通过几种方法去除蛋白质、其他杂质和溶液中的酶，最后将纯的核酸物质从溶液中沉淀出来。
核酸提取的方法有很多种，下面将介绍常用的几种方法。
1. 酚/氯仿法（Phenol/Chloroform Extraction）：这是最常用的核酸提取方法之一、首先将细胞样本加入到含有酚和氯仿的溶液中，酚能溶解脂质，破坏细胞膜；然后离心使其分为两相，上层为水相，下层为有机相。
水相中含有核酸和水溶性杂质，有机相中含有脂质和非水溶性杂质。
将上层水相取出，通过分子筛或盐的作用去除水相中的酚、蛋白质等杂质，最后通过异丙醇沉淀法将核酸沉淀下来。
2. 硅胶柱层析法（Silica Column Chromatography）：这是一种常用的纯化核酸的方法。
首先将细胞样本经过裂解步骤释放核酸，然后将裂解液加入硅胶柱中，硅胶能够吸附核酸。
通过洗涤和洗脱的步骤去除杂质，最后将纯度较高的核酸溶液从硅胶柱中洗脱出来。
3. 盐沉淀法（Salt Precipitation）：这是一种简单快速的核酸提取方法。
首先将细胞样本经过裂解步骤释放核酸，然后加入盐溶液（如氯化钠），通过高盐浓度的作用沉淀核酸。
通过离心将核酸沉淀下来，去除杂质。
最后通过加入适当的溶剂将核酸溶解出来。
4. 柱层析法（Column Chromatography）：这是一种基于分子大小差异的核酸提取方法。
首先将细胞样本经过裂解步骤释放核酸，然后将裂解液加入到一个具有分子层次的柱中。
根据核酸的大小和形状差异，通过洗涤和洗脱的步骤将目标核酸从其他杂质中分离出来。
除了以上介绍的几种方法，还有磁珠萃取法、酵素消化法等核酸提取方法。
这些方法各有优缺点，可以根据实验的需要选择适合的方法。
需要注意的是，在进行核酸提取过程中，应当避免核酸样本的污染，一些常见的措施包括使用丙酮等剂去除有机物和酶，使用无菌工具和试剂，以及进行负控实验等。
核酸的提取实验报告
一、实验目的1. 熟悉核酸提取的基本原理和实验操作步骤。
2. 掌握从动物组织中提取核酸的方法。
3. 了解核酸提取过程中需要注意的问题。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
本实验采用动物组织作为材料，通过破碎细胞膜和核膜，提取其中的核酸。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：动物肝脏、生理盐水、无水乙醇、氯仿、异丙醇、氯化钠、EDTA、Tris-HCl缓冲液、DNA酶、RNA酶等。
2. 实验仪器：研钵、研杵、移液枪、离心机、电热炉、紫外分光光度计、恒温水浴锅、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 取新鲜动物肝脏，用生理盐水清洗，去尽血液，切成小块。
2. 将肝脏块放入研钵中，加入适量EDTA和Tris-HCl缓冲液，用研杵充分研磨，制成匀浆。
3. 将匀浆转移到离心管中，加入氯仿，剧烈振荡，使蛋白质和脂质与核酸分离。
4. 4℃、12,000 rpm离心15分钟，取上清液。
5. 将上清液加入等体积的异丙醇，静置2小时，使DNA沉淀。
6. 4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃去上清液，用75%乙醇洗涤DNA沉淀。
7. 将DNA沉淀干燥，用适量Tris-HCl缓冲液溶解。
8. 通过紫外分光光度计测定DNA浓度。
9. 重复步骤2-8，提取RNA。
五、实验结果与分析1. 通过紫外分光光度计测定，DNA浓度为2.0 μg/μl，RNA浓度为1.5 μg/μl。
2. 从实验结果可以看出，DNA和RNA的提取成功，且提取效率较高。
六、实验讨论1. 在实验过程中，选择合适的动物组织是保证实验成功的关键。
本实验选用动物肝脏作为材料，因为肝脏中DNA和RNA含量较高，易于提取。
2. 在提取过程中，要尽量减少蛋白质和脂质的干扰。
本实验通过加入氯仿和异丙醇，使蛋白质和脂质与核酸分离。
3. 在实验过程中，要注意温度、pH值和离心速度等条件，以保证核酸的稳定性和提取效率。
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最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶 液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇， 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的 阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的 负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 对 精残留，酒精抑制 策 后续酶解反应
应的杂质，是目前较为理想的选择。
RNA提取常见问题
RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 总量偏低
RNA降解
➢ 样品取样以及保存是否得当 ➢ 裂解液的质量 ➢ 外源RNase的污染 ➢ 裂解液的用量不足 ➢ 组织裂解不充分 ➢ 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很
4. 低温沉淀，延长沉淀时间 5. 加辅助物，促进沉淀 6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤
液吸出，勿倾倒
RNA提取
RNA的提取
➢ 异硫氰酸胍/苯酚法（如Trizol法） ➢ CTAB法 ➢ 试剂盒法
异硫氰酸胍/苯酚法
➢ 原理：
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变 性，核酸释放；
➢ 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 , 而 CT A B 则溶于乙醇.
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分 子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。 ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多 酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到 DNA 分子上而致 D N A 降解；
多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉 淀下来，影响植物核酸纯度。
改良方法 1
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
难避免 RNA 的降解。
OD260 /OD280 比值偏低
蛋白质污染：
➢ 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
➢ 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底
➢ 苯酚残留：
➢ 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
抽提试剂残留：
硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。
改良方法 2
加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞， 去除部分杂质，离心得到细胞核；
针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS 清洗2-3次，去除多糖；
后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。
核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP
3. DNA中残留有金属离 子
1. 重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对 策
3. 提取过程操作过于剧
烈，DNA被机械打断
• 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体 系中的中间相和水相，从而得以分离；
• 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
Trizol法适用于普通的植物组织、动物组织 以及真菌和细菌等。
• 酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合， 导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时 RNA的丢失，或形成不溶性复合物；
核酸提取原理及常见问题
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取常见问题、
原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 酚氯仿法 ➢ 试剂盒法
CTAB法（植物DNA提取经典方法）
反复冻融
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 对
策
3. 沉淀不完全 4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料
2. 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁
3. 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量）
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
CTAB
PVP β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V) 2-5%(W/V)
1-5%（V/V）使 用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
❖ 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二
解决方案：加入糖原，帮助RNA沉淀 多提几管，最后合并溶解。
常见的几种RNA条带
正常条带
植物叶片
水生生物和昆虫等 “ 隐裂”现象
真菌和细菌等
动物组织
➢ 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。
➢ 设备限制：
➢ 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。
用水稀释样品：
➢ 测 OD 时，用水作为跟组织本身的RNA丰度有关，一般代谢旺盛 的组织RNA得率会比较高。
影响RNA提取的因素
材料：
➢ 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 ➢ 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料
贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－80℃保存 ➢ 液氮长期保存，－80℃短期保存
样品破碎及裂解：
➢ 根据不同材料选择不同的处理方法：
• 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 • 酵母和细菌：直接液氮研磨，之后用Trizol裂解 • 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。有些样品如
• 而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀 下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA 的化学降解和酶解。
针对多糖多酚植物，可以采用CTAB法和 Trizol法结合的方法，针对性的去除多糖多 酚。
对于富含色素、蛋白和多糖的藻类，可采 取试剂盒方法。
组织量较少的样品，在沉淀时刻加入糖原， 增加终浓度等。
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨，以充分研磨。
• 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量
纯化：
➢ 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； ➢ 经典的沉淀方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，
易造成 RNA 降解； ➢ 异丙醇沉淀，用时短，但所获得的RNA杂质较多； ➢ 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反
CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂 质
SDS法流程图
动物组织
抽提
组织匀浆
上层溶液
细胞裂解
酒精沉淀
离心洗涤 干燥溶解