分子生物学试验设计
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计实验目的：利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物（大肠杆菌）。
实验材料和仪器：1.食品样品（可能受到大肠杆菌污染的食品样品）2.大肠杆菌纯培养物3.DNA提取试剂盒4.PCR试剂盒5.扩增仪6.DNA凝胶电泳仪7.DNA标记物8.电泳凝胶9.UV透射仪实验步骤：1.向含有大肠杆菌的培养物中添加适量的无菌水，制备测定标准曲线用工作溶液。
通过适量稀释，确保能获得包含一定数量大肠杆菌的工作溶液。
2.称取加热灭活的食品样品，如肉类或蔬菜，使用细菌培养基作为负对照。
3.提取食品样品中的细菌DNA。
使用DNA提取试剂盒，按照生产商的说明书操作，从食品样品中提取总DNA。
4. 设计适用于大肠杆菌的引物。
从GenBank数据库中检索适合大肠杆菌的引物序列并合成引物。
5.进行PCR扩增反应。
在PCR反应管中加入模板DNA，引物和PCR试剂盒提供的反应液，将其放入扩增仪中进行PCR扩增。
6.准备凝胶和电泳条件。
在适当的浓度下制备琼脂糖凝胶，并根据引物大小和预期DNA片段大小调整电泳条件。
7.进行PCR产物的电泳检测。
取PCR反应混合液5μL，以及DNA标记物，放入琼脂糖凝胶槽中进行电泳。
8.照相检测结果。
使用UV透射仪照射电泳凝胶，检查PCR产物的大小和带。
如果有大小适合的带出现，则该食品样品中存在大肠杆菌。
9.分析结果。
根据电泳凝胶的结果，判断食品样品中大肠杆菌的存在与否。
实验注意事项：1.实验过程中保持操作环境的高度无菌。
2.准备PCR反应混合液时，避免污染和交叉污染。
3.扩增后的产物严禁回收，以避免引入假阳性结果。
4.进行凝胶电泳时，注意电泳条件的调整，确保PCR产物可以清晰可见。
总结：该实验利用分子生物学方法对食品中的致病微生物（大肠杆菌）进行鉴定。
通过提取食品样品中的细菌DNA，并使用PCR扩增大肠杆菌特异序列，通过电泳检测分析PCR产物的大小和带，判断食品样品中是否存在大肠杆菌。
分子生物学综合设计性实验 (2)
分子生物学综合设计性实验实验项目：不同限制性内切酶对质粒DNA的切割学院：生命科学学院年级专业班：生科121姓名：廖怡诚学号：1214100058实验地点：生化楼207指导老师：夏岩石摘要：限制酶是一种能将双链DNA切开的酶。
主要作用于DNA分子内的磷酸二脂键，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。
切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。
每种限制酶能识别特定的碱基序列并进行特异切割，所以理论上加入的限制酶能够根据其特异性判断会得出的DNA片段。
通过电泳跑胶能够对得出的片段进行分析粗略判断与理论长度的吻合度。
一、关键词：限制酶酶切质粒DNA 电泳二、引言：自然界中限制性酶具有降解外源的DNA的能力，对保护宿主遗传稳定有着重要的作用。
但随着基因工程的发展，对限制酶的应用尤为重视。
由于它具有识别特定DNA序列并进行切割的能力，在基因工程中进行目的基因的导入发挥着重要的作用。
可以取长补短，增强对人类有益生物产品的产量和质量，如导入的抗铃虫基因的木棉大幅度提高了木棉的产量。
但由于，导入基因与受主本身基因结合后存在着不可预判性，可能导致生物危机，也可能随机的酶切将基因导入后产生异常的新物种。
但总体而言，限制酶对于人类基因工程的研究有着重要的意义，对于导入优越基因剔除无用基因有着很大的发展前景。
如进行疾病的治疗（基因治疗），从内在对致病基因进行剔除或置换上优越基因的研究，对于人类生命的延续无疑有着重要意义。
而研究限制酶最为基础之一就是要了解它识别序列的特性和作用机理，所以本实验选取了多种限制酶，可以随机搭配进行对已确定的质粒DNA进行酶切之后进行电泳分析，可以研究限制酶酶切后的序列长度以及多种限制酶的加入在识别位点时是否会互相干扰。
通过实验结果验证理论的准确性以及对实验过程中出现的不可预测的因素导致的各种结果的分析。
对于进一步了解限制酶的作用机理有更深的认识，为以后限制酶的研究奠定良好的基础。
分子生物学实验设计
分子生物学实验设计彭杰 2012141241104摘 要：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein^GFP)是源F 海洋生物多管水母属 (aequoia victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发卜一发岀绿色荧光, 能在活细胞内稳左表达，本试验首先从含有GFP 的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒 纯化质粒，采用氯化钙法将工程菌DH5a 制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好 的感受态细胞中，使得工程菌DH5a 转化成具有抗氨节青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋 白，接种于加氨节青霉素的LB 培养基上，筛选阳性克隆。
实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21实验材料:2、低温离心机 4、超净工作台 6、琼脂糖凝胶电泳仪系统 8、凝胶成像系统(Dark Reader) 10、10、100、1000 uL 微量移液器各一支 12、恒温培养箱14、漩涡混合器(二) 材料1、 少量含PEGFP-N3和pET ・28a 质粒的菌液2、 限制酶 BamH I 51 - G^GATCC • 3’一 5' GGATCC 31 3'- CCTAG 个G -51 — 3' CCTAGG 513、 限制酶 Not I S'-GC^GGCCGC- S'^S^-GC GGCCGC-313'・・・CGCCGG 个 CG-bK-CGCCGGCG …51 4、 0. 2mL EP 管架5、 1.5ml 塑料离心管6、 一次性手套7、 大肠杆菌DH2a 和BL218、 氯化钙 氢氧化钠 乙醇氯仿 蔗糖 硼酸9、乙二胺四乙酸(EDTA)10. 三疑甲基氨基甲烷(Tris)11、 氨节青霊素22、浪酚蓝13、 P CR 产物快速胶回收试剂盒14、 d NTP 混合物15、 引物对(正反向引物)16、 E x-Taq 酶 「DNA 连接酶17、 酵母提取物 胰蛋白腺 氯化钠18、 小指管.吸头、培养皿.三角瓶、试管等 (三) 试剂• 1> LB 培养液:胰蛋白丿冻(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g, NaCl5g, 琼脂(固体培养基)15g,用IN NaOH 调pH 7.5。
分子实验
分子生物学实验设计方案学院：专业班级：课程：实验名称：组员：实验日期：1、学习与掌握利用ITS序列鉴定真菌的原理；2、掌握用ITS序列鉴定真菌的方法有步骤。
二、实验原理1、菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，是传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。
内转录间隔区ITS(internal transcribed space), 位于5.8S和18S之间（ITS1）以及5.8S和28SrDNA 之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。
近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区域既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。
随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。
2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区。
是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。
用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S 和ITS2。
真菌ITS 区域长度一般在650 ～750 bp( 碱基对)。
ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。
ITS鉴定的原理：rDNA 上的5 .8 、18 和28 SrRNA 基因有极大的保守性, 即存在着广泛的异种同源性。
而由于ITS 区不加入成熟核糖体, 所以ITS 片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。
在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性, 即使是亲缘关系非常接近的 2 个种都能在ITS 序列上表现出差异, 显示最近的进化特征。
植物的分子生物学实验研究
03
实验设计和方法
实验材料和准备
植物材料
选择适当的植物种类和 组织，如叶片、根、茎 等，用于提取DNA、 RNA或蛋白质。
试剂和溶液
准备用于实验的各种试 剂和溶液，如DNA提取 液、RNA提取液、PCR 反应液、电泳缓冲液等 。
仪器和设备
准备实验所需的仪器和 设备，如离心机、PCR 仪、电泳仪、分光光度 计等。
实验优化
根据实验结果和数据分析，对 实验设计和方法进行优化和改 进，提高实验的准确性和可靠
性。
04
实验结果和分析
实验结果展示
基因表达谱分析
通过RNA-seq技术，获得了植物在不同发育阶段或不 同处理条件下的基因表达谱数据。
蛋白质组学分析
利用质谱技术，鉴定了植物细胞中的蛋白质种类和丰 度变化。
代谢组学分析
研究假设
假设通过基因编辑技术可以实现 对植物生长发育关键基因的精准 调控，从而提高植物的产量和品 质。
研究范围和限制
研究范围
本研究将针对植物生长发育过程中的关键基因进行实验分析，包括基因克隆、 表达分析、功能验证等方面。
研究限制
由于实验条件和时间的限制，本研究将主要关注某一类或某几个关键基因的研 究，不涉及全基因组范围内的分析。同时，实验结果可能受到实验材料、环境 等因素的影响，需要在后续研究中加以验证和完善。
表达分析
利用Northern blot、 Western blot等技术对基因表 达产物进行分析。
数据收集和处理
数据收集
记录实验过程中的各种数据， 如DNA浓度、RNA浓度、PCR
产物大小等。
数据处理
对收集到的数据进行整理、统 计和分析，如绘制图表、计算 相关性等。
分子生物学实验设计
菌菌属系统发育提供详实的分子证据。
三、实验设计
3.1实验材料 在野外调查时采集研究材料，新鲜牛肝菌采集后用硅胶干燥或自然风干 后备用。 3.2实验仪器 电子天平；水浴箱；常温超速离心机；北京六一仪器厂电泳槽；Bio Rad电泳仪；WD-9403F型手持紫外分析仪；GE9700 PCR仪； Beckman UV640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪。 3.3 实验试剂 1×CTAB DNA提取液；TE缓冲液；氯仿；苯酚；异戊醇；异丙醇；β巯基乙醇；乙酸钠；70%乙醇；76%乙醇；核酸染料；上样缓冲液（含 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）；dNTP；DL2000Marker；DL5000Marker； MgCl2；10×Buffer；TapDNA聚合酶；NS1/NS8引物；LROR/LR5引 物。
具体实验步骤：
3.7.1 PCR体系参数的优化
PCR扩增体系中，Taq酶用量、镁离子浓度、dNTP、引物及模板浓度 及退火温度均会对扩增结果产生影响，其中扩增模板浓度与退火温度对其 影响最大，直接关系到扩增产物的多少和有无。采用正交实验设计方法， 以Taq酶浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度四种因素，取A、B、C 3种水平，见表2，对PCR反应体系进行优化。
一、研究概况
在云南，可食用的牛肝菌主要根据子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”， “黄牛肝”和“黑牛肝”，其中“白牛肝”即实际分类学上的“美味牛肝菌” 在贸易中占有重要的地位。从分类学上看，广义的美味牛肝菌复合群包括以下 5个种:美味牛肝菌(Boletus edulis Ball.ex Fr)、褐红牛肝菌(B.pinophilus Pilát & Dermek)、铜色牛肝菌(B.aereus Ball.ex Fr)、网纹牛肝菌(B.Reticulates Schaeff)和夏生牛肝菌(B.aestivalis(Paul.)Fr)这5个种。
分子细胞生物学实验设计
1.请你设计一个离体实验证明SRP和SRP受体的功能。
答: 实验中首先要分离SRP、SRP受体和微粒体, 并要有克隆的分泌蛋白的基因, 然后在无细胞蛋白质合成系统中进行蛋白质合成实验。
主要做法是: 在无细胞翻译体系中如果不加SRP、SRP受体、微粒体，分泌蛋白只能合成一条带有信号序列的完整多肽；如果加入SRP、但不加入SRP受体和微粒体，新生肽的合成在完成70-100个氨基酸时被阻断,因为SRP已经与信号序列结合并中止了蛋白质的翻译,但由于找不到受体,SRP不能被释放,所以蛋白质不能继续合成；如果反应体系中加有SRP和SRP受体,但没有微粒体，也能够合成完整的具有信号序列的多肽，并且会伴随GTP的水解而释放出SRP颗粒。
如果在反应体系中同时加有SRP、SRP受体和微粒体，将会合成一条成熟的没有信号序列的多肽，并且释放到微粒体中。
2.请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体。
答: 可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下：①克隆线粒体基质蛋白基因;②在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白;③检测分离后将合成的蛋白质分成两组,一组直接加入胰蛋白酶,另一组先加入线粒体,然后再用胰蛋白酶蛋白酶处理;④结果分析: 如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解, 即可证明加入线粒体后, 线粒体蛋白进入了线粒体。
因为胰蛋白酶是水溶性的酶,不能进入线粒体,所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。
3.请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧?答:①用相对分子质量大而不能透过细胞质膜的胰蛋白酶处理胰蛋白酶完整的细胞:这种处理可以将跨膜蛋白的朝向外侧的肽水解,而位于脂双层和细胞质面的部分则不受影响。
②用非离子去垢剂或渗透休克提高膜的渗透性,让膜失去了对蛋白水解酶渗透的障碍作用, 结果使膜蛋白的细胞质部分被蛋白酶水解。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子生物学实验设计田益夫（2013141241072）唐子林（2013141241127）（一）实验目的获得发绿色荧光的细菌。
（二）实验概述通过体外扩增目的基因eGFP并构建表达载体pET-28a-eGFP转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。
（三）实验步骤及材料1 实验准备与质粒提取1.1 实验材料及试剂含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml）,工作浓度100μg/ml；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase的双蒸水。
1.2 实验仪器恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。
1.4实验具体步骤1.4.1 仪器准备与培养基的配置（1）取两个250ml锥形瓶，各配置100ml固体/液体LB培养基，（2）按照体系将以上物品分别加入两个烧杯中，加入80ml去离子水混匀溶解。
加入琼脂的培养基在石棉网上加热溶解。
（3）用1N NaOH调节PH至7.5，倒入250ml锥形瓶中，与装好的平板一起放入高温灭菌锅内121℃灭菌20min。
（4）将包好的平板，枪头（10、100、1000μl），EP管，三角瓶等常用仪器放入高温灭菌锅内121℃灭菌30min。
（5）将灭菌后的常用仪器放置于干热灭菌箱内保存备用。
（6）取一支200μl移液枪，200μl枪头一盒，灭菌后的培养基、灭菌后的平板等放于紫外灯下照射30min。
（7）待培养基降温至50℃左右，各加入Kana霉素10μl。
（8）倒5个平板于4℃冰箱储存备用。
1.4.2 扩大培养及菌保（1）取两个已经灭菌的50ml三角瓶，配好的LB(Kana)培养基，移液枪和一盒枪头（100μl）放入超净台中紫外灯下照射30min。
（2）向两个50ml三角瓶中分别加入已配好的约10mlLB（Kana）液体培养基，再用移液枪分别移取10μl带有pEGFP-N3质粒的菌液和10μl带有pET-28a质粒的菌液于恒温摇床上37℃、220rpm过夜培养。
（3）取已高温灭菌的EP管，LB（Kana）液体培养基，1000μl 枪头和移液枪，甘油于紫外灯下照射30min。
（4）向6个EP管（每种菌做3管甘油菌保存）各中加入800μl 摇好的菌液（呈浑浊）和200μl甘油配置20%的甘油菌于-20℃下菌保。
1.4.3 碱裂解法提取质粒（1）取1.5ml菌液于1.5mlEP管中，10000rpm x 2min，弃去上清液，重复一次，弃去上清液。
（2）加入100μl溶液I，漩涡器上充分混匀，室温下放置10min。
（3）配制70%乙醇，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）和氯仿/异戊醇（24：1）备用。
（4）向（2）中加入200μl新制溶液II，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。
（5）加入150μl预冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使之混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。
（6）10000rpm x 5min，取上清液于另一干净离心管中。
（7）向上清液中加入等体积（约400μl）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，（10000rpm x 10min），将上清液转移至新的离心管中。
（8）加入等体积（约370μl）氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心2min，取上清液于新离心管中。
（9）向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
（10）12000rpm x 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（11）加0.8ml 70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或温室自然干燥30min。
（12）加入20μl含RNase的双蒸水，-20℃保存备用。
1.4.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定（1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mlxTAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
（2）待胶液冷却至65℃，加入1μlGold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡。
（3）缓慢倒入事先准备好的制胶有机玻璃槽（插入样品模版梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
（4）胶板放入电泳槽中（样孔位于负极），注入1xTAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μl与1μl Loading Buffer (6x)混匀，加入胶板上的样品孔内。
（5）将电泳槽于电泳仪接通，调节电压为100v左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。
（6）将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
2 质粒酶切与连接2.1 酶切位点分析和引物设计2.1.1通过PCR扩增获得目的片段的方法：EGFP基因序列：ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTG GACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCC ACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCC TGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAG GAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAG TTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAG GACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTAT ATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGC GACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGC AAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCC GGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG TAAEGFP酶切位点分析：（http://users.unimi.it/camelot/tools/cut2.html）The following endonucleases were selected but don't cut this：sequence:………………NgoAIV, NgoMI, ……………… VspI, XbaI,选用引物：（用于后续菌落PCR检测等）F-P1: 5’’R-P2:5’’Xho l2.1.2通过直接没切质粒获得目的片段的方法：实验方案分析:在左图质粒EGFP 基因前的多克隆位点（MCS ）上有酶切位点BamHI, 而在EGFP 基因末尾有一个NotI 酶切位点；在质粒pET-28a 的MCS 上也含有这两个酶切位点，因此可以直接酶切更方便地从质粒上酶切获得目的片段再进行连接构建表达载体pET-28a-EGFP 。
2.2 实验材料及试剂pEGFP-T1质粒模板, 双蒸水，10 x Buffer, MgCl2, 移液枪及枪头，4xdNTP, 正向引物，反向引物，Taq 酶， 0.2ml EP 管，一次性手套，凝胶成像系统，恒温培养箱。
2.3 实验仪器台式高速离心机，PCR 仪，琼脂糖凝胶电泳仪。
2.4 实验流程2.5 实验步骤2.5.1 PCR 扩增目的片段（1）取一个0.2mlEP 管配制50μlPCR 反应体系反应物 ddH2O 10xBufferMgCl2 4xdNTP 正向引物 反向引物Taq 酶 质粒模板体积（μl345321113（2）混匀后瞬时离心PCR 扩增目的基因片段 对pEGFP-N3进行酶切回收 对pET-28a 进行酶切回收电泳检测目的片段确实存在将回收产物进行连接（3）放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min。
②94℃变性30s。
③55℃退火30s。
④72℃延伸60s。
⑤重复②~④30次。
⑥72℃延伸10min。
（4）取5μl反应液加入1μl 10x loading buffer做电泳检测，分析所的片段大小，确定EGFP确实存在于质粒中。
2.5.2 酶切获得目的片段（1）分别取两支0.2mlEP管做好记号：如①②（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。
（4）取5μl①②EP管酶切反应液，同时取5μl原质粒溶液做对照，进行电泳检测酶切结果。
（5）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
2.5.3 DNA连接重组（2）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃保存用于转化。
3 转化E.coli DH5α扩增质粒并提取转化BL213.1实验材料及试剂感受态大肠杆菌DH5α，LB(Kana)固体培养基，DNA模板，4xdNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，Marker DNA, 10xBuffer , 15mmol/l MgCl2，感受态大肠杆菌BL21，碱裂解法提取质粒的试剂等。
3.2 实验仪器碎冰机，水浴锅，高速台式离心机，恒温摇床，PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，移液枪及枪头,碱裂解法提取质粒的仪器等。
3.3 实验流程3.4 实验步骤3.4.1 热击转化大肠杆菌（1）取出感受态细胞DH5α让其在冰上自然融化，每200μl 解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。
（2）42℃热击90s，立即置于冰浴5min。
（3）在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。
（4）6000rpm x 3min，去掉上清液（约留下200μl培养液），摇匀菌块。
（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。