病毒学 第七章：病毒基因

说，中段是非必需的。
2、λ噬菌体的缺陷与改造
λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有 5个 BamH1位点（G↓GATCC ）， 6个 BgⅠ位 点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。
⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。接纳源自9kb×5%=2.45kb的 DNA。
M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质: 复制蛋白(基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ) 形态发生蛋白(基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ) 结构蛋白(基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、 Ⅷ 和 Ⅸ )。 基因组 DNA 为正链，按基 因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与 噬菌体的 mRNA 序列同义。
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
M13 DNA载体的构建：
• 构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因ph和p10， 为病毒复制非必须基因。 • 多角体基因ph和p10有非常强大的启动子，可使目的基 因大量表达，可达细胞总蛋白量的25%。
• 杆状病毒基因组较大（130Kb），适合克隆大片段外原
基因，还可以同时表达几个基因。 • 杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。
二、典型的杆状病毒表达系统
昆虫杆状病毒表达载体系统（bculovrirus expression vector system，BEVS）于20世纪 80 年代初期问世，已被公认为当今基因工程四大表 达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动 物细胞表达系统）之一，应用最广的是苜蓿丫纹
夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)与S9细胞系。
cI
LA 32.7
λgt 10 lac Z
EcoR I
RA10.6
LA 19.9
EcoR I
RA21.9
Charon 16A
是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、 抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段， 其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使 少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用 于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片 段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段 的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然 而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补 能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的 筛选，又称为蓝白斑筛选。
（2）替换型载体：只有DNA的长度大于野生型的75%而
不超过105%，才能包装成噬菌体。插入外源基因20kb。
没有外源基因插入的噬菌体不能包装。
（3）cos质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下
λDNA两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒
的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos 质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源
同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再 连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或 双链片段的交换。
杆状病毒表达体系的优点： 加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免
• 杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰， 疫原性和功能上均与天然蛋白相似。
止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。
当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上
产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。 此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负 链为模板在切口的 3' 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的 合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环 经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染 开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的 作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转 录并继续合成子代正链 DNA 。
绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，
当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞 内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋
白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ
mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎 只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限
SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumor antigen， T抗原)，其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。 T抗原有以下的作用: ① 通过抑制宿主细胞Rb和p53基因，促使细胞分裂； ② 阻止细胞凋亡； ③ 结合在SV40的复制起点，起始病毒复制； ④ 关闭病毒早期转录； ⑤ 启动病毒晚期转录； ⑥ 在病毒组装中起作用； ⑦ 小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。
AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同 源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病
毒。BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成， 其技术路线分以下几步：
① 先将外源片段克隆到转移载体质粒中，置于杆状病毒启动子 控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列， 构建成转移载体； ② 然后把转移载体和野生型病毒共转染昆虫细胞，通过同源重 组将外源片段插入到病毒基因组； ③ 再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。
AcMNPV是有囊膜的闭合环状dsDNA病毒，的基因表达分为
4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和 极晚期基因表达。 其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它 们是多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体的主要成 分，感染后期在细胞中的积累可高达30％ ～50％，是病毒复制 非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感 染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病 毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶 解有关。多角体基因和 P10基因现在都已被定位和克隆，这两个 基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆 状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大
肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖肠杆菌的M13噬菌体为单链环状DNA M13噬菌体的生物学特性：
M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和 正链DNA组成。DNA全长6407个核苷酸，基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质， DNA上有11个基 因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔 位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间， 其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。成熟的 噬菌体只感染雄性大肠杆菌， M13噬菌体不裂解宿 主细胞，但抑制其生长。 2700个外壳蛋白分子
尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质。 ②中段：长约20kb，位于基因J和N之间，是λDNA整合和 切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最
重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区
域内。 左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组
装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来
λ噬菌体的改造 λ噬菌体的改造
⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更 大）； ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶ 增加标记基因（remarker gene）。
（1）插入型载体：
λ噬菌体载体相对于质粒载体来kb外来DNA。 •cI基因插入失活： 如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及Hind III的酶 切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导 致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。 •LacZ基因插入失活： 如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因 上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF
DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。
• 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出 来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方 法再次导入细胞。
三、动物病毒载体
1、SV40（猴病毒40）病毒作为载体
（1）SV40基因组（多瘤病毒科） 其基因组为共价闭合环状双链DNA，只有5243个碱基对。是第一个 完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
（2）SV40的复制和增殖 •SV40感染敏感的猿猴细胞后，经过8-12小时的潜伏期，脱去外 壳， DNA进入细胞核。 •首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生T和t抗原。 •当两种抗原积累到足够量时，DNA开始复制，同时启动晚期转录， 翻译产生壳蛋白VP1、VP2、VP3 ，将DNA包装成病毒颗粒。 •当细胞内病毒颗粒多达105时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
polylinker lacZ
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
（+）DNA M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 II