BD淋巴细胞亚群分型
淋巴细胞亚群的临床及科研应用
NK细胞(CD3-CD16+和/或CD56+)能够介导 对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性 作用。
下表为常见疾病的T 淋巴细胞的变化：
疾病
T 细胞亚群 CD4+/CD8+
类风关
CD4+ （活动期）
CD8+
SLE
- 或 （活动期）
Sjogren综合症
多发性硬化症
重症肌无力
膜型肾小球肾炎
胰岛素依赖性糖尿病
乙型肝炎
自身溶血性贫血
上呼吸道感染
传染性单核细胞增多症
（急性期）
巨细胞病毒感染
乙肝
（急性期/慢性肝炎）
结核
（胸水/重症外周血）
麻风
疟疾
血吸虫病
43;
Reversed CD4/CD8 Ratios of Tumor-Infiltrating Lymphocytes Are Correlated with the Progression of Human Cervical Carcinoma Received February 11, 1999; revision received May 21, 1999; accepted May 21, 1999. © 1999 American Cancer Society
CD4/CD8比值与肿瘤
恶性肿瘤患者术前CD4/CD8比值低与术后比 值恢复正常。
当发生癌转移时,CD3 、CD4 细胞数明显减 少的同时CD8 细胞数明显增多,CD4/ CD8 比 值明显降低,提示恶性肿瘤患者晚期细胞免疫 功能更低,预后更差。
BD流式全面介绍
Creation of a Voltage Pulse - Analog Signal
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以 定量
流式细胞仪系统
简介 —通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
Fluorescence signals
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
FITC和PE荧光 光谱
步骤二：
染色
—体积 —温度 —孵育时间 —对照
直接染色
— Fluorescent probe attached to antibody
— Specific signal: weak
细胞功能
细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原
细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
600 nm
700 nm
淋巴细胞亚群测定
1检验目的检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等）的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
2 检验方法和原理2.1 方法：流式细胞术2.2 原理：在含有准确数量荧光计数微球的试管(如BD TruCount)中，加入一定体积的抗凝血液和六色荧光素标记的单克隆抗体进行免疫荧光染色，按溶血／免洗方法进行流式细胞仪检测，以CD45／SSC设定淋巴细胞门，应用FACS Canto软件自动进行多重逻辑设门和统计分析数据，可以准确计数血液中淋巴细胞亚群的绝对数量。
3 原始样本种类3.1 样本类型：KEDTA抗凝静脉血样本。
2EDTA或肝素抗3.2 样本容器：盛放样本的容器为洁净的一次性真空采血管（K2凝）。
3.3 样本保存：抽取样本后置于加有抗凝剂（一般选择EDTA或肝素）的试管中，室温（20-25℃）保存，尽量于采血后48小时内处理样本；标记后的样本最好在24小时内完成上机检测。
4设备和试剂4.1 设备名称：BD FACS Canto II流式细胞仪型号：Canto II厂家：美国BD公司4.2 试剂4.2.1 主要试剂本实验采用BD公司的试剂。
4.2.1.1 BD MultiTEST 6-color TBNK Reagent货号：337166规格：1ml厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
只有相同批号的各种成分才能相互混用。
4.2.1.2 绝对计数管（TruCOUNT Tubes）货号：340334规格：25tubes/盒厂家：美国BD公司储存条件：2-25℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
TruCOUNT Tubes 从冰箱拿出后需平衡至室温，方可打开包装袋。
每次用前，需要检查包装袋内的干燥剂，如果由蓝色变成粉色，则TruCOUNT Tubes不能继续使用。
4.2.1.3 溶血素Lysing Solution（10X Concentrate）货号：349202规格：100mL厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
流式细胞术临床检测项目操作流程
流式细胞术临床检测项目操作流程临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。
抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在 4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体1ML 2―8℃ 2：全血溶血试剂A：甲酸 70ML 室温 B：碳酸钠等32ML 室温 C：多聚甲醛 14ML 室温3：鞘液 20L 室温 4：清洗液5L 室温 5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
BD淋巴细胞亚群分型
活化总T细胞
有助于了解移植、自身免疫、免疫缺陷、免疫失调及T-ALL时细胞激活状态。如外周血单核细胞表面HLA-DR的表达与手术和创伤后患者的预后成正相关，可作为手术患者一种可靠的免疫监测手段了解病人的天然免疫，有助于防止感染。
1.2-5.8%
CD14+/HLA-DR+
活化的单核细胞
CD4+/CD25+/Foxp3+
调节性T细胞
CD4+CD25+/Foxp3+调节性T(Treg)细胞是维持机体免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节（dominant regulation）的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力，如防止自身免疫性疾病的发生。CD4+CD25+/Foxp3+细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生，可用于骨髓移植术前术后的跟踪。
414～1123 cells/μl
CD4+T淋巴细胞＞100/μl的病人。
③帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗。
④抗HIV药物疗效的重要判断指标。
CD8+/CD38+
活化CD8细胞
CD38亚群细胞是一群激活亚群，当HIV感染时高度扩增，对疾病的进程有重要的预后意义。是HIV感染患者发展为AIDS或死亡的更灵敏的预后指标。临床还用于监控骨髓和器官移植。
项目名称
项目说明
临床意义
正常值范围
CD3+
总T细胞
外周血淋巴细胞亚群及绝对值
外周血淋巴细胞亚群及绝对值
外周血淋巴细胞亚群及绝对值是指在外周血液中，淋巴细胞被分为不同的亚群，并计算出每个亚群的绝对值。
这些亚群通常包括T 细胞、B 细胞和自然杀伤细胞等。
这个测试是一种用于评估免疫系统功能的血液检测。
以下是一些可能包含在外周血淋巴细胞亚群报告中的内容：
1. CD3+ T 细胞：CD3+ T 细胞是一类T 淋巴细胞的亚群，它们在免疫应答中扮演重要角色。
CD3+ T 细胞包括CD4+ T 细胞（辅助T 细胞）和CD8+ T 细胞（细胞毒性T 细胞）。
2. CD4+ T 细胞：CD4+ T 细胞是一种辅助T 细胞，它们协助B 细胞产生抗体，也是调控免疫应答的关键成分。
3. CD8+ T 细胞：CD8+ T 细胞是细胞毒性T 细胞，它们能够直接杀伤感染细胞或异常细胞，起到清除病原体和控制肿瘤的作用。
4. CD19+ B 细胞：CD19+ B 细胞是B 淋巴细胞的亚群，它们主要负责产生抗体，参与抗体免疫应答。
5. NK 细胞（自然杀伤细胞）：NK 细胞是一类对病毒感染和肿瘤细胞有杀伤作用的大型颗粒淋巴细胞。
6. 淋巴细胞总数：这是所有淋巴细胞的总数，包括T 细胞、B 细胞和NK 细胞等。
7. 绝对值：除了百分比之外，外周血淋巴细胞亚群报告还包括各个亚群的绝对值，这是指每种细胞类型的具体数量。
这些数据的检测和分析有助于医生了解患者的免疫系统状况，特别是在评估免疫系统功能、监测治疗效果或诊断免疫相关疾病时。
全血淋巴细胞亚群免疫分型
全血淋巴细胞亚群免疫分型背景知识即使在早期通过形态学特征来区分不同功能的淋巴细胞的检测中，对直接识别和计数方法的研究一直在进行。
吸附方法在历史上有重要地位，这个方法首次假设了通过一些新的分子探针来检测膜上的受体或配体来识别细胞。
单克隆抗体被证明是检测这种表面分子极其有效的探针；此后CD 命名协会统一命名了与这些表面分子结合的种类繁多的抗体。
将单克隆抗体进行荧光标记后与白细胞反应，然后在流式细胞仪上检测，这个基本步骤使流式细胞仪在临床实验室中应用被大大拓宽。
对外周血淋巴细胞免疫分型在诊断和分型免疫缺陷性疾病中意义重大。
如检测与X染色体相关丙球蛋白贫乏症患者外周血淋巴细胞CD19、CD20和CD21时，会发现在疾病状态中的患者不存在成熟B淋巴细胞（CD19+，CD20+，CD21）。
另一个例子是分析CD43的表达，它在Wiskott-Aldrich 综合症患者的淋巴细胞的表达降低。
区分严重的联合免疫缺陷症病例，是通过患者淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8和CD38的表达来将新诊断病例来进行的。
进一步的有关淋巴细胞分型在免疫缺陷症在临床中的应用请参阅其他文献资料(Keren et al., 1994)。
HIV病毒感和获得性免疫缺乏综合症，是流式细胞仪免疫分型外周血淋巴细胞运用最为广泛的适用病种。
CD4阳性T细胞是HIV感染的主要靶分子，通过几种机制它们被催毁,并且其数量随着疾病的进程而下降。
根据一些学术机构的报告，临床上对潜在的感染危协而进行的抗病毒或预防治疗决定，是依据对CD4+T细胞的计数而做出的；因此对这些病人的淋巴细胞亚群的精确检测就显得十分重要。
毫无疑问，全球数量不断增加的HIV/AIDS病人和对CD4+T细胞快速而精确检测的需要使得流式细胞仪使用在临床实验室中日益广泛。
这一点很好地解释了为什么为这个单一应用发展了相关的试剂和仪器，和一些针对CD4+T细胞检测的标准化程序。
外周血淋巴细胞免疫分型被证明在诊断患有某些慢性淋巴细胞增生性疾病的患者中有重要作用；特别是B细胞性慢性淋巴细胞白血病，此类样本中可以通过B 细胞表面κ 和λ免疫球蛋白轻链的异常表达而识别出肿瘤细胞。
淋巴细胞亚群分析六项
淋巴细胞亚群分析六项淋巴细胞亚群分析是淋巴细胞的一种重要的分析技术，它可以用来检测自身免疫功能，特别是对肿瘤的抗肿瘤免疫功能的诊断。
它还可以用来检测某些病毒对淋巴细胞亚群的影响。
淋巴细胞亚群分析六项是淋巴细胞亚群分析的一种基础，它包括六个部分：第一，白细胞计数：它是用来测量淋巴细胞的数目的一种技术，可以用于判断炎症反应的强度。
第二，淋巴细胞比率：它是一种测量淋巴细胞数目和白细胞数目关系的方法，可以用来评估身体对病原体的反应。
第三，B细胞比率：它是一种测量B细胞数量和总淋巴细胞数量比例的方法。
B细胞数量过多或过少可能会引起疾病，所以它是判断是否出现疾病的重要指标。
第四，T细胞比率：它用来测量T细胞数量和总淋巴细胞数量的比例，可用来评估身体免疫力水平，预测是否有发生自身免疫性疾病的风险。
第五，单核细胞比率：它是一种测量单核细胞数量和总淋巴细胞数量的比例的方法，可以用来评估身体免疫力水平，预测某些感染病毒的风险。
第六，前体细胞比率：它是一种测量前体细胞数量和总淋巴细胞数量的比例的方法，可以用来评估身体免疫力水平，预测是否有发生淋巴组织炎的风险。
淋巴细胞亚群分析六项是一种重要的淋巴细胞检测技术，它可以用来诊断某些疾病，特别是抗肿瘤免疫功能的诊断、评估自身免疫水平，以及预测感染病毒的风险。
因此，正确有效地进行淋巴细胞亚群分析六项是非常重要的。
然而，在淋巴细胞亚群分析六项中存在一些技术问题。
首先，淋巴细胞亚群分析六项的结果可能会受到技术因素的影响，比如不同的技术人员和不同的仪器，会对淋巴细胞亚群分析六项的结果产生影响。
其次，由于淋巴细胞的状态会受到各种因素的影响，如营养、运动、疾病、情绪、药物等，因此，淋巴细胞亚群分析六项的结果也会受到这些因素的影响。
为了解决这些技术问题，首先，需要确保技术人员具备正确的技术知识和技能，确保仪器及时维护，确保淋巴细胞亚群分析六项的结果准确可靠；其次，需要提高检测者的生活习惯，如坚持合理饮食，保持适当的运动，注意情绪管理，避免过度服药，等，以免影响淋巴细胞亚群分析六项的结果。
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50-84%
CD3+/CD4+
T辅助/诱导淋巴细胞
27-51%
CD3+/CD8+
T抑制/毒性淋巴细胞
15-44%
CD3-/CD19+
B淋巴细胞
5-18%
CD3-/CD16+56+
NK淋巴细胞
7-40%
15.0-25.0%
项目名称
项目说明
临床意义
正常值范围
CD3+
总T细胞
淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它可以辅助诊断某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等)，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义；
1．CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者。
CD3+/HLA-DR+
活化总T细胞
有助于了解移植、自身免疫、免疫缺陷、免疫失调及T-ALL时细胞激活状态。如外周血单核细胞表面HLA-DR的表达与手术和创伤后患者的预后成正相关，可作为手术患者一种可靠的免疫监测手段了解病人的天然免疫，有助于防止感染。
1.2-5.8%
CD14+/HLA-DR+
活化的单核细胞
CD8+/CD28-
抑制性T细胞
9.9-24.8%
CD4+/CD4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱRO+
T辅助细胞诱导亚群
检测记忆型CD4+细胞亚群，CD45RO阳性，某些病毒感染性疾病处于进展期时它的数量增加，当接受抗病毒治疗后其数量又会下降。
9.8-26%
CD4+/CD45RA+
抑制细胞诱导亚群
用于检测幼稚型CD4+细胞亚群, CD62L阳性，当某些病毒感染性疾病处于进展期时它的数量下降，而当接受抗病毒治疗后其数量又会增加。在后一种情况下，它有助于区分病人在经抗病毒治疗后，免疫细胞（如CD4）数量增加是由于外周血中现有淋巴细胞亚群扩增而产生的纯真细胞，还是胸腺增生和真正的免疫重建。
CD4绝对数
T辅助细胞绝对计数
CD4+T淋巴细胞计数测定的主要意义：
①用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴细胞＜200/μl或CD4+T淋巴细胞的百分比＜14%的HIV感染者可归入艾滋病。
②判断HIV感染者的临床合并症(各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性)，如CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞＜50/μl的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞＞100/μl的病人。
2．CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。
3．CD4／CD8比值异常：艾滋病患者比值显著降低，多在0．5以下。比值降低：SLE肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等。比值增高:见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排异反应。
③帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗。
④抗HIV药物疗效的重要判断指标。
414～1123 cells/μl
CD8+/CD38+
活化CD8细胞
CD38亚群细胞是一群激活亚群，当HIV感染时高度扩增，对疾病的进程有重要的预后意义。是HIV感染患者发展为AIDS或死亡的更灵敏的预后指标。临床还用于监控骨髓和器官移植。
CD8+/CD28+
细胞毒T细胞
检测细胞毒/抑制性T细胞，CD8+/CD28+为细胞毒T细胞，CD8+/CD28-为抑制性T细胞；可作为一些自身免疫性疾病、艾滋病及免疫缺陷的免疫检测指标。CD28+亚群随HIV病程发展时数量降低。急性乙肝患者外周血CD8+CD28+细胞呈现明显的升高。
8.6-15.5%
CD4+/CD25+/Foxp3+
调节性T细胞
CD4+CD25+/Foxp3+调节性T(Treg)细胞是维持机体免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节（dominant regulation）的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力，如防止自身免疫性疾病的发生。CD4+CD25+/Foxp3+细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生，可用于骨髓移植术前术后的跟踪。