全血淋巴细胞亚群免疫分型

全血淋巴细胞亚群免疫分型背景知识即使在早期通过形态学特征来区分不同功能的淋巴细胞的检测中，对直接识别和计数方法的研究一直在进行。

吸附方法在历史上有重要地位，这个方法首次假设了通过一些新的分子探针来检测膜上的受体或配体来识别细胞。

单克隆抗体被证明是检测这种表面分子极其有效的探针；此后CD 命名协会统一命名了与这些表面分子结合的种类繁多的抗体。

将单克隆抗体进行荧光标记后与白细胞反应，然后在流式细胞仪上检测，这个基本步骤使流式细胞仪在临床实验室中应用被大大拓宽。

对外周血淋巴细胞免疫分型在诊断和分型免疫缺陷性疾病中意义重大。

如检测与X染色体相关丙球蛋白贫乏症患者外周血淋巴细胞CD19、CD20和CD21时，会发现在疾病状态中的患者不存在成熟B淋巴细胞（CD19+，CD20+，CD21）。

另一个例子是分析CD43的表达，它在Wiskott-Aldrich 综合症患者的淋巴细胞的表达降低。

区分严重的联合免疫缺陷症病例，是通过患者淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8和CD38的表达来将新诊断病例来进行的。

进一步的有关淋巴细胞分型在免疫缺陷症在临床中的应用请参阅其他文献资料(Keren et al., 1994)。

HIV病毒感和获得性免疫缺乏综合症，是流式细胞仪免疫分型外周血淋巴细胞运用最为广泛的适用病种。

CD4阳性T细胞是HIV感染的主要靶分子，通过几种机制它们被催毁,并且其数量随着疾病的进程而下降。

根据一些学术机构的报告，临床上对潜在的感染危协而进行的抗病毒或预防治疗决定，是依据对CD4+T细胞的计数而做出的；因此对这些病人的淋巴细胞亚群的精确检测就显得十分重要。

毫无疑问，全球数量不断增加的HIV/AIDS病人和对CD4+T细胞快速而精确检测的需要使得流式细胞仪使用在临床实验室中日益广泛。

这一点很好地解释了为什么为这个单一应用发展了相关的试剂和仪器，和一些针对CD4+T细胞检测的标准化程序。

外周血淋巴细胞免疫分型被证明在诊断患有某些慢性淋巴细胞增生性疾病的患者中有重要作用；特别是B细胞性慢性淋巴细胞白血病，此类样本中可以通过B 细胞表面κ 和λ免疫球蛋白轻链的异常表达而识别出肿瘤细胞。

对骨髓细胞免疫分型可确定慢性B淋巴细胞白血病的亚型(Loken et al., 1990; Ruiz-Argüelles et al.,1998)。

在使用移植药物后，T细胞的亚群会发生改变，特别是CD4+T细胞会因为免疫抑制而有特异性的改变。

病人在服用咪唑硫嘌呤或环孢霉素后CD4+和CD29+T细胞数量会下降，而CD4和CD45RA阳性的T细胞会增加。

同时表达CD4和CD57的淋巴细胞的数据，一群功能尚在研究中的细胞，会在服用咪唑硫嘌呤的病人中增加，而在服用环孢霉素病人则不会。

有些文献报道CD4/CD8比值低的病人其排斥反应增加的机率增大，并且会变现出对抗排斥药的耐药。

CD8+T细胞的HLA-DR表达的增加可被识为早期排斥反应的信号，同时是抗排斥药物疗效下降的指标。

T细胞亚群细胞比例失衡会在慢性免疫性疾病中见到，如系统性红斑狼疮，结缔组织疾病，进行性系统性硬化症和风湿性疾病，此外还有文献表明T细胞亚群细胞比例的改变程度与疾病的活跃程度相关。

在mononucleosic综合症中，CD4和CD8细胞的构成会发生戏剧性的变化，而当其比例正常时则可认为疾病进入临床缓解期。

在以上提及的临床应用中，对外周血淋巴细胞的区分、计数和分型分析一旦与一些淋巴细胞的其他表型和功能性标志物联合检测时，将会得到更多的实用信息。

如刺激某个淋巴细胞亚群，如T，B，或NK细胞，使其分泌细胞因子或表达与活化相关的蛋白，或凋亡标志物及其他。

定义参数选择抗体外周血淋巴细胞免疫分型中的一个严格步骤是选择所使用的抗体。

除了选择在高质量的荧光标记抗体，还要选择其克隆号和荧光素，及用来识别细胞的特异和敏感的标志物，这些是进行成功分析的必要因素。

举个例子，虽然CD19和CD20被认为是B细胞的特异性标志物已经有数年了，现在发现正常T细胞的一个亚群也会表达CD20，从而限制CD20在识别外周血B淋巴细胞的特异性。

所以要遵从一些学术机构或专业组织所提供的操作指南，从而可减少分析中的不确定因素。

在这个环节上，还要对仪器的设置和校准特别注意，来控制其中的变异。

尽管使有直接荧光标记抗体、红细胞裂解液能有效地去除非特异性染色，但恰当的质控对照还是需要的，如使用冻干/标准化的细胞或细胞系先来检测第一次使用的抗体，从而确认其稳定性如何。

统计淋巴细胞的绝对数量近些年来在流式细胞仪上直接进行绝对计数成为了可能。

这个应用迅速在诊断实验室中开展。

在此要强调的是，一旦进行这类检测，样本要作免洗溶血、染色上机检测步骤。

在此情况下，对吸取样本和标准微球的体积要作严格校正，建议使用反吸法操作。

在进行白细胞计数时，血液中的白细胞会在血球计数仪上被识别并计数，这里特别要确认血球仪的检测精度。

样本制备样本储存、运送和制备是一些会影响淋巴细胞计数准确性的重要因素，举例来说，低温对CD4+T 细胞活性的影响较对CD8+细胞大，而当进行密度法离心分离淋巴细胞时，能很好地富集到CD4+细胞，因为CD8+细胞在此过程中会被选择性地丢失。

所以要遵从一些学术机构或专业组织所提供的操作指南，从而可减少分析中的不确定因素。

同型对照使用荧光标记的同型对对照来去除非特异性染色已被一些学术机构强调了很多年。

然而，这些同型对照在去除抗体与淋细胞表面特异性结合以外的信号时，其效果远不如理想中那样。

尽管生产厂商宣称这些试剂是专门用于此目的的，但因为纯化方法，蛋白结构和标记荧光素与那些特异性抗体之间经常会有很大差异。

因此，可考虑使用可与阴性细胞明显相区分的抗体来作免疫分型分析。

采集细胞的数量运用推荐抗体染色标本，并将识别出淋巴细胞显示在高散或帕松图上。

根据统计学，为了获得一个可接受的变异能数（<10%），最少收集的阳性细胞要在100个以上。

在健康的正常人中，淋巴细胞中群体最少的是NK细胞，通常在3%以上。

这样，最少要分析3000个淋巴细胞才能满足以上条件。

然而，在AIDS病人中其CD4+T细胞在1%左右的并不少见，所以此时要采集10000个淋巴细胞分析。

一个保险的方法是将仪器分析设置在分析10000个淋巴细胞停止条件上。

死亡细胞标本储存时间延长或不够，或样本的转运都会引细胞死亡，且淋巴细胞各亚群的死亡情况很少一样，所以各亚群细胞被其中死亡细胞影响的结果也各不相同。

减少死亡细胞的影响的最好方法是阻止细胞死亡。

样本采集后要立即进行处理分析，但当采样地点与流式分析室有距离，那么必须对样本的运输、抗凝和温度等因素加以考虑。

根据CDC的建议，使用EDTA抗凝的样本可以在30小时内分析，而那些用ACD或肝素抗凝的样本则可在48小时内分析，而此时样本不失去其活性。

无论何种情况，样本都要保存在室温下运输(21° to 25°C)，并避免极端温度。

当样本不满足这些条件时，要重新抽取样本。

当无法再获得样本时，可以考虑通过密度离心法来分离去除红细胞和死细胞。

预测结果当检测淋巴细胞亚群时，必须与病人样本一起同时检测一个正常人样本，并且此样本的检测结果要落在正常值范围之内。

各细胞亚群的检测值参考范围必须由实验检测50-100例正常人得出。

在分析正常人样本或病人样本时，必须考虑到年龄生理改变对T细胞亚群检测的影响。

如正常人外周血样本不能每天抽取，则可考虑使用商业化的冻干淋巴细胞作为质控。

这些细胞可作为样本间和染色程序及仪器操作的质控品。

此外不同的淋巴细胞表达现不同的光散射特征。

如NK细胞TCR-γδ+ T 细胞, 和CD8+/TCR-αβ+ T 细胞较B淋巴细胞有更高的光散射信号值。

CD4阳性T细胞通常相互异质与并在FS双参数图上与B细胞和NK细胞相混。

一些常见的检测结果见图1，2，3。

实验方案在免疫法区分和计数外周血淋巴细胞的检测中，常因抗体的选择问题而导致严重的检测偏差，而这些对感染了HIV病毒病人的外周血淋巴细胞的免疫分型检测已十遍及。

在这种情况下，出台了几种可精确检测CD4阳性T细胞可靠的抗体组合方案（CD4现仍是临应床上监测HIV感染病人免疫状况的理想指标）。

表1、2、3罗列了美国疾控中心所推荐双色、三色和四色对HIV患者外周血淋巴细胞免疫分型方案。

一个适当的分型方案应能够提供最精确地、明确地区分出各类细胞亚群。

方案中所选抗体应能够最大限度地反应出整个标本中细胞的信息，提供样本管之间的对比质控来保证各个测定管之间的结果的一致性。

方案设计中不仅要检测阳性标本，还要包括阴性群体来作阳性标本荧光强度的对照。

美国疾病控制中心制定了一套检测T淋巴细胞亚群的方案，可作为参照来检测样本。

表一，双色法Tube Number FITC PE Use1CD45CD14光散射坐标设门2CD3CD19总T和B淋巴细胞3CD3CD4总T和CD4阳性T淋巴细胞4CD3CD8总T和CD8阳性T淋巴细胞5CD3CD16 and CD56总T和NK细胞IgG 阴性对照6 IgG淋巴细胞通过FS和SS信号圈出，并其中CD45强阳性细胞>98%，CD14阳性细胞<2%。

各管中的CD3可作为检测管之间变异质控，四管中CD3的计数要的变异值要在3%之内。

表二，三色法组合抗体检测目的A a CD3/CD4/CD45b以 CD45++ 和 SSC设门, 计数CD3/CD4细胞CD3/CD8/CD45b以 CD45++ 和 SSC设门, 计数CD3/CD8细胞CD3/CD19/CD45b以 CD45++ 和 SSC设门, 计数CD3/CD19细胞B c CD3/CD19/CD16-56计数 T, B, 和 NK 细胞CD3/CD4/CD8计数总T (CD3), CD3/CD4, 和CD3/CD8细胞a组合A推荐在没有直接绝对能力的流式细胞仪上，这种方案无需阴性对照，因为通过CD45的荧光强度可以识别出各白细胞亚群。

b重复检测的CD3可作检测管之间变异监测，各管之间的相差应在3%以内。

c组合B推荐使用在有直接绝对计数功能的流式细胞仪上。

表三，四色法抗体检测目的管 1a CD3/CD4/CD8/CD45以 CD45++ 和 SSC设门, 计数总T，CD3/CD4和CD3+/CD8+ T细胞管 2b CD3/CD19/CD56/CD45以 CD45++ 和 SSC设门, 计数总T，B细胞和NK细胞a重复检测的CD3可作检测管之间变异监测，各管之间的相差应在3%以内。

b可用CD16取代CD56，或者同时加入颜色相同的两种抗体。

CD45和CD14在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散射坐标上区分淋巴细胞群体或其他细胞。