大曲中红曲霉的简易分离方法

大曲中红曲霉的简易分离方法李晓楼（四川职业技术学院，四川遂宁 629000 ）摘要：本文采用无菌过滤收集大曲中红曲霉孢子悬液和基内接种技术，运用稀释平板法，实现了从大曲中简易分离红曲霉，文章介绍了红曲霉的生物学特征，阐述了从大曲中分离红曲霉的原理、分离培养基的设计与制作、大曲中红曲霉分离纯化的技术方法及过程，为获取红曲霉纯菌及红曲生产爱好者提供参考。

关键词：大曲；红曲霉；分离；基内接种；稀释平板法红曲霉的用途非常广泛，利用红曲霉生产红曲，古称丹曲，是我国古代的伟大发明。

红曲不但用于酿酒，而且还应用于发酵食品、食品色素等方面[1] 。

此外有的红曲霉能产生 Monacolin 类活性物质，具有很强的降低胆固醇的作用；某些红曲霉种还含有较高的麦角甾醇，可防止婴儿佝偻病，促进孕妇和老年人对钙、磷的吸收；另外有报道红曲霉的有些种还有酯化能力[2] 。

因此有关红曲霉在酿酒、保健、食疗等方面的作用越来越受到人们的重视。

本文采用无菌过滤收集大曲中红曲霉孢子悬液和基内接种技术，运用稀释平板法，实现了从浓香型大曲中简易分离红曲霉，文章介绍了红曲霉的生物学特征，阐述了从大曲中分离红曲霉的原理、分离培养基的设计与制作、大曲中红曲霉分离纯化的技术方法及过程，为获取红曲霉纯菌及红曲生产爱好者提供参考。

1 红曲霉的生物学特征红曲霉（Monascus sp . ）是腐生菌，分布较广，常存于乳品或乳制品中，多数出现在乳酸自然发酵的基物里，制曲作坊和大曲等都是它们适宜的繁殖地。

红曲霉属于不整子囊菌纲、散囊菌目、红曲科、红曲属。

已描述过的红曲霉约有19 个种[3] 。

1.1 形态特征红曲霉一般多用麦芽汁琼脂培养。

在生长的过程中能形成红色色素，菌落初为白色，老熟后变成淡红、紫红等颜色。

菌丝有隔，多核，多分枝。

分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或以向基式生出 2 — 6 个成链，形状多为梨形，闭囊壳球形，内散生 10 多个子囊，子囊球形，内含有 8 个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子留在闭囊壳内[4] 。

1.2 生理特性红曲霉的最适温度一般在30 ℃—35 ℃ ，25 ℃ 以下40 ℃ 以上不利于生长。

最适 pH 值一般在 3 —5 ， pH 值在 3 以下，生长缓慢， pH 值在 5 以上，不利于色素的形成。

同时酿酒用的红曲霉能够耐受一定的酒精度[4] 。

2 大曲中红曲霉的分离原理根据红曲霉的生物学特征以及生理特性，在适合红曲霉生长的培养基中加入选择性抑制剂，设计制作成适合红曲霉生长的选择性分离培养基，选取富含红曲霉的优质大曲为菌源，无菌过滤，收集红曲霉孢子悬液，采用稀释平板分离可以得到较纯红曲霉[5] 。

3 分离培养基的设计与制作选择性分离培养基的设计与制作，是成功分离红曲霉的关键。

设计与制作红曲霉选择性分离性培养基，包括设计原理；配方以及制作过程。

3.1 设计原理选择性分离培养基是利用目的微生物对各种化学物质敏感程度的差异，在培养基中加入选择性抑制剂，用以抑制非目的微生物的生长，并使目的微生物生长繁殖，从而实现红曲霉的纯种分离。

3.2 具体配方根据红曲霉分离的原理，设计麦芽汁琼脂培养基加选择性抑制剂用于红曲霉分离。

具体配方： 8 —10 波美度的麦芽汁 900ml ，无水乙醇 100ml ， 25g 琼脂，然后用乳酸调 pH 值在 4.0 左右， 1.05kg /cm 2 灭菌 20 分钟即成选择性分离培养基。

使用前加 30ppm 的链霉素 1ml — 2ml ，用于抑制原核微生物如细菌和放线菌的生长。

3.3 制作过程取小麦若干，用水洗净，浸水 6 —12 小时，15 ℃ 阴暗处发芽，当麦根长至麦粒的两倍时，摊开烘干。

将干麦芽磨碎，取 1 份麦芽加 4 份水，在65 ℃ 水浴锅中糖化 3 — 4 小时，然后用 4 — 6 层纱布过滤，滤液用鸡蛋清法除浊后稀释到 8 — 10 波美度。

按 3.2 设计配方配制， 1.05kg /cm 2 灭菌 20 分钟即成[5] 。

4 大曲中红曲霉的分离方法与技术4.1 方法稀释平板法（ pour plate method) 即运用无菌操作，将目的菌源微生物用无菌水作梯度稀释，取定量菌液通常不超过 1ml 于无菌培养皿中，然后倒入融化冷却至50 ℃ 的培养基，混合摇匀，凝固后倒置、恒温培养 1 —3 天，就会出现单菌落，达到纯种分离的目的。

稀释平板法，接种温度较高，接种器具简单，适合于利用孢子悬液等分离。

4.2 技术根据红曲霉的生物学特征及其生理特性在红曲霉的分离纯化过程中主要采用了基内接种技术和无菌过滤收集孢子悬液技术。

4.2.1 基内接种技术基内接种技术是相应于稀释平板法而言的，菌液接种于培养基的内部，菌液与培养基充分混合，基内接种技术，接种温度较高，可使某些热敏感菌死亡，同时培养基内部缺氧，某些好氧菌的生长受到抑制，可减少非目的微生物在培养基上的生长，而红曲霉的孢子有一定的耐受性和抗逆力，因此影响不大。

4.2.2 无菌过滤收集红曲霉孢子悬液技术采用无菌过滤收集红曲霉孢子悬液，用于红曲霉纯菌分离，可以缩短分离纯化的次数，确保分离培养基平板上的红曲霉菌落是单菌落，同时红曲霉孢子的耐受力较强，有一定的抗逆性，适合基内接种。

4.2.2 .1 无菌过滤装置的准备用一玻璃短柄漏斗，在漏斗柄和颈结合处包棉花成棉塞状，将漏斗柄插放到试管或三角瓶内，棉塞要松紧适宜（以手握漏斗，试管或三角瓶不掉为准），漏斗内放折叠好的圆锥形滤纸，要求滤纸边缘低于漏斗边缘，然后用牛皮纸将整个漏斗包扎，灭菌备用。

4.2.2 .2 无菌过滤操作用无菌小刀在漏斗的牛皮纸上划一锐角形小口，在无菌环境中，用无菌镊子掀起小口，将待滤样液缓缓倒入漏斗，样液不要超过滤纸边缘。

完毕后，轻轻取下漏斗，保留棉塞，注意旋转一下棉塞，以消除棉塞中部的小孔。

所得滤液即为基内接种的孢子悬液。

5 大曲中红曲霉的分离纯化过程5.1 大曲的选取选取有红心的优质中高温大曲，无菌粉碎备用。

红心大曲的选取，目的性强，可以缩短分离时间，减少分离过程中目的菌种的富集培养。

5.2 红曲霉的分离从红心大曲中分离得到红曲霉纯菌，要经过一系列的过程，在整个过程中，无菌操作和无菌意识显得尤为重要，包括以下过程。

5.2.1 无菌水的制备量取 90ml 蒸馏水于 250ml 三角瓶中，塞上棉塞，包扎，另取 2 支18mmX180mm 的试管，分装 9ml 蒸馏水，塞上棉塞，包扎。

1.05kg /cm 2 灭菌 20 分钟。

5.2.2 红曲霉孢子悬液的制备与稀释将无菌粉碎的红心大曲粉 10g 浸泡在装有 90ml 无菌水的三角瓶中振荡20 分钟，无菌过滤，滤液即为 10 -1 浓度的红曲霉孢子悬液，用 1ml 的无菌滴管吸取 10 -1 浓度的孢子悬液 1ml 于一管 9ml 的无菌水中，吹洗三次，摇匀得 10 -2 浓度的红曲霉孢子悬液，同样到 10 -3 浓度的红曲霉孢子悬液。

5.2.3 平板分离取 9 套无菌培养皿，依次编号为 10 -1 ， 10 -2 ， 10 -3 ，，每个稀释度设两个重复即各三个。

采用基内接种技术，用 1 支 1 ml 无菌滴管从低浓度开始，分别吸取 1ml 菌液于相应编号的培养皿内，要求吸前摇匀样液。

然后将融化冷却到50 ℃ 左右的分离培养基（向培养基中加入 30ppm 的链霉素 1 —2ml ，）倒平皿，旋转平皿，使培养基和孢子悬液充分混匀。

冷凝后倒置于培养箱中32 ℃ 恒温培养 2 — 4d ，注意观察菌落的形态和颜色。

5.2.4 红曲霉的转接从稀释平板上选取菌落初为白色，老熟后变红、紫红的菌落无菌操作转接到麦芽汁琼脂试管斜面上32 ℃ 恒温培养 6 — 7d ，作好标记。

5.2.5 红曲霉的纯化如果转接的菌苔不纯，可在培养 7 天左右后，向试管中无菌操作加入 10ml 无菌水，用接种铲刮洗菌苔，无菌过滤，将滤液按 5.2.2 、 5.2.3 操作，进一步纯化、培养、转接即得红曲霉纯种。

注意纯化时孢子悬液的稀释度，最好取 10 -3 ， 10 -4 ， 10 -5 三个稀释度，因为此时的菌相当于经过了富集培养，较纯，孢子数量大，浓度较高。

5.2.6 镜检取洁净的无菌载玻片，加一滴乳酸石碳酸液。

用接种针挑取分离转接的试管红曲霉菌丝少许，在液滴中涂布，盖上盖玻片，火焰固定后镜检。

观察菌体的形态、菌丝的形态、有无横隔，分枝情况；分生孢子着生方式、形状；有无闭囊壳及其形状等鉴定是否是红曲霉。

镜检后将确定的红曲霉菌种作好标记。

5.2.7 红曲霉菌种的保藏将分离得到的纯种红曲霉作好标记后冰箱保存备用。

在实践生产中可以用试管麸皮法保存红曲霉，该方法简单、实用，保存时间较长。

总之，采用上述方法，从大曲中分离红曲霉，目的性强，成功率高，简便易行，耗时短，同时分离得到的红曲霉来源于大曲，有一定的糖化力和耐酸性，在实际生产上有更大的实用价值。

参考文献：[1] 傅金泉．我国红曲生产与应用的现状及发展前景 [J] ．食品与发酵， 1995 ，（ 5 ）[2] 毛宁，陈松生．降脂红曲霉的生产研究 [J] ．中国酿造， 1997 ，（ 5 ）[3] 颜耀祖．真菌分类学 [M] ．北京：中国农业大学自编教材， 96~98[4] 傅金泉．中国红曲及其实用技术 [M] ．北京：中国轻工业出版社， 1997[5] 周群英，高廷耀．环境工程微生物学 [M] ．北京：高等教育出版社， 2000 作者介绍：-- 《中国西部科技.学术》 2007年第5期 --。