第二十五章 药物生物转化

静态菌体悬浮方式：菌体充分生长后，离心得到的菌体悬浮在水或适当
的缓冲液中，再加入甾体进行转化。
混合培养方式：以A出发转化成B，需要两种以上的酶参与，单独转化费
时费力，所以常采用混合培养的方法，可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。 固定化方式：一次制成的菌液反复用于转化是可行的，为了避免溶菌， 需要将其固定在水不溶载体上进行转化。
•
在微生物转化过程研究最多的是固 定化活细胞包埋技术。常用的包埋材料 有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯 (PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、 葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PVA)等。 • 以海藻酸钙凝胶为例，其制备过程如 下：在室温条件下，将一定浓度的海藻 酸钠溶液与微生物细胞混合均匀后，滴 加到氧化钙溶液中，形成球珠。
甾体合成技术的演进
1950年Kendall, Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺 贝尔奖。 1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素， 反应共需31个步骤，产品售价每克$200； 1952年利用Peterson利用黑根霉产生的羟化酶将反应过程缩短为3个步
最为常见的生物转化反应，在甾体药物合成上应用较多。 环氧化反应是生物转化中的一个重要类型，C=C经氧化可形成环氧化 合物，可生产磷霉素。
还原反应
许多醛类，无论式脂肪族，还是芳香族，饱和或不饱和，羟基或卤素 取代都能被微生物还原成醇。
缩合反应
麻黄碱：利用微生物将苯甲醛和乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮，再与
第二阶段：
微生物转化阶段，一般在生长阶段结束
时加入底物溶液，有些还需加入诱导剂。
常用的转化方法
• 分批培养转化法
• 利用酶进行生物转化
• 应用渗透细胞进行生物转化 • 应用孢子进行生物转化
• 应用固定化细胞进行生物转化
• 应用干燥细胞进行生物转化 • 静息细胞转化法
微生物转化的过程
微生物转化实验概要过程如下： 选择需要的菌株 选择合适的转化方式 培养成熟菌丝或孢子 转化培养或转化菌丝及孢子
四、超声波技术在微生物转化中 的应用
• • 超声波是指频率高于2×104Hz的机械波。 与其他声波一样，超声波可以在弹性介质中传 播。因为超声波的波长很短，所以具有很强的定 向传播能力。同时由于超声波在液体和固体中传 播时吸收衰减很小，因此具有很强的穿透力。
• 根据超声波的使用范围，常可以将其分为两类： 一类是高频超声，频率范围为I~10MHz，这一类 主要用于医学成像和化合物结构的分析；另一类 是功率超声，频率范围为15～60kHz，主要用于 过程强化反应。
甲胺缩合，用活性铅还原，得麻黄碱。
脱氢反应
可的松脱氢后苯环形成双键，具有较高的抗炎活性。
碳链氧化降解
该法是降解甾体物质侧链的重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制 备香草醛为例。
第三节 微生物转化在药物中应用
甾体微生物转化
甾体指的是固醇或皮质类激素，由于这 类激素都含有相同的结构，所以统称 为甾体 类激素。甾体在临床上应用十分广泛，解热 镇痛，消炎杀菌等。
• 固定化细胞，基因重组等技术的发展，能将几种不同合成基因构
建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微 生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。
微生物转化的不同阶段 第一阶段：
菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给 菌体丰富的营养，使其充分繁殖发育。（温 度，pH，通气条件，培养及成分。）
• 超声波技术应用于微生物转化过程，主 要是涉及固液传质的生物体系。超声波 可以产生上述的效应，较常规方法更有 效地细化颗粒、增大传质表面。 • 这一过程主要发生于固液两相界面及细 胞壁、细胞膜附近的区域。在超声场中， 进行微生物转化的环境和菌体均处于不 断的振动中。
• 对于环境而言，可加强分子的扩散效应， 加速体系的混匀过程，减少各种代谢在液 相中的梯度；对于菌体而言，可降低其细 胞内胞液的黏度，提高膜的通透性。 • 阳葵等等报道了采用超声强度，超声方式 和时间对绿僵菌(Metarhizium sp．)氧化16α,17α-环 氧黄体酮的影响，并对微生物转化体系中 的超声效应进行分析，
• 双水相技术的核心是成相介质的选择以及 介质浓度的控制，它直接影响到底物和产 物在两相中的分配。 • 双水相体系基本上可以分为两大娄：高聚 物-高聚物体系和高聚物-低分子物质体系。
• 高聚物一高聚物体系是较常用的，典型的例子如 在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，当它们浓 度达到一定时．溶液变浑浊，静止后形成两个液 层，上层富集了PEG，下层则是葡聚糖。 • Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35组成的双水 相体系，利用分支杆菌(Mycobacterium sp.)进行胆固醇 侧链降解制备雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1， 4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上层聚乙二醇富 集了菌体，使得菌体具有较高的转化活力，转化 速率可达到1.0mg／(g· h)。
骤，产品售价每克$6；
1980年使用突变的分支杆菌分解植物油中的固醇以作为原料，产品价 格每克$0.46。
甾体生物转化的类型
羟化反应 环氧化反应 脱氢反应 A环芳构化 还原反应 水解反应
羟化反应
孕酮
皮质激素
环氧化反应
A环芳构化
脱氢
甾体生物转化的原理和方法
甾体生物转化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白质等的发酵。 而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一ห้องสมุดไป่ตู้位进行特定的化学反应获得
• 应用超声波技术，首先受到机械力的作用，而 机械能又可以转化为热能。此外，当声强足够 大时，又能产生空化效应。 • 超声波的机械效应包括振动效应和声流效应， 指超声在媒介中传播时引起质点振动以及声流 对质点的剪切力； • 超声波的热效应指超声波在媒介中传播的过程 中被传播介质吸收转变为热能； • 超声波的空化效应指超声波激活气泡各种动力 学的表现形式。
的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶，我们需要确保菌体产酶的
最佳条件，诱导所需要的酶，抑制不需要的酶。
在菌体生长期结束后加入甾体底物，由于其不溶于但能溶于可 与水按一定比例混溶的有机溶剂，再加入培养液中转化。
根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式：
生长培养方式：在微生物培养的中后期加入底物，一边培养，一遍转化。
第二十五章
药物生物转化
第一节 微生物转化反应概述
生物转化
是指外来化合物在体内，细胞或酶的作用经过一系列化学变化形
成其衍生物或分解产物的过程，也成为代谢转化。
生物转化常利用生长中的菌体，休止的菌体，酶，固定化酶以及 固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一 性和立体专一性。
微生物转化的发展
二、固定化细胞转化技术在微生物转化中 的应用
• 固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以 来．已经广泛应用于工业、农业、医学、环境 保护、能源开发以及理论研究等方面，并取得 了丰硕成果。 • 利用固定化细胞转化技术，省去了破碎细胞提 取胞内酶的过程，完整细胞得到固定后，酶活 损失较少，活性回收率高，并且保持了细胞内 原有的多酶体系，对于一些需要多步催化的反 应过程，一步即可完成。 • 被固定的微生物细胞可以是处于生长状态或体 眠状态的活细胞也可以是死亡的细胞(但胞内酶 的活力仍 存在)
• Kaul等采用了海藻酸盐固定化生物催化剂 (简单节杆菌)和底物(氧化可的松)进行碳一 位和二位脱氢反应研究。 • 每个凝胶珠都可以看成是一个小的生物反 应器，由于缩短了扩散距离，转化率明显 提高，反应结束后细胞还可以回收并重复 使用
三、双水相转化技术在微生物转化中的应 用
• 双水相转化技术早期主要用于生物分子和细胞 的分离与纯化。 • 这是由于生物产品如蛋白质和酶往往是胞内产 品，需要经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞 颗粒尺寸的变化给固一液分离带来了困难，另 外这些产品的活性和功能对pH值、温度和离子 强度等环境特别敏感．为了克服这些缺点．出 现了双水相技术。近年来，该技术开始应用于 微生物转化过程．为生物催化过程引入了一种 全新的反应体系
影响甾体生物转化的因素
物理因素
搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。
培养基的组成
碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。
产物的分析与分离方法
纯化
需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化 液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱 法得到较纯的甾体转化物。
• 如，应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合 成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以 用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，反应液含丝 氨酸超过400g／L，再从丝氨酸与吲哚转化生成色 氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200g／L。 • 此外．利用基因工程还可以将能进行生物转化的 相关酶从微生物、植物甚至动物细胞中克隆出 来．再导入一个微生物中进行表达，从而产生能 对底物进行转化的一系列酶，将原来复杂的几种 转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面的 研究也是微生物转化的一个趋势，并且具有广阔 前景。
悬浮液转化
转化液的分离提取
产品纯化
微生物转化的特点
• 由有活性中心都和特殊空间结构的酶作为催化剂； • 酶催化作用的速度极快； • 在常温常压和中性条件下进行高效转化反应，简化设备，降低成本； • 生物转化的专一性，故底物不要求很纯（Ex. 粗淀粉）
• 转化过程容易调节（简单的用酸，碱，温度，离子调节）
• 转化过程产生杂质少，过程无毒，无臭，无味，可用于食品，医疗。 • 把含酶细胞或酶本身固定在载体上，可使转化过程连续化。 • 酶来源广泛。 • 可以实现化学反应无法做到的转化。