Caspase
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
caspase
Caspase家族Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。
Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。
由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。
Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。
线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。
线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。
人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE （interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b切割下来。
在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。
进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。
Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。
Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。
《caspase蛋白》课件
深入了解Caspase蛋白的结构和功能，探索其在细胞凋亡和疾病中的重要作用。
概述
什么是Caspase蛋白？
Caspase蛋白是一类关键的囊泡内蛋白酶，参与细胞凋亡和炎症反应等生物学过程。
Caspase蛋白的功能
Caspase蛋白在细胞的正常生理过程和疾病发展中发挥关键作用，如信号传导和废弃机制。
多种转录因子可以调控Caspase基因的表
翻译后调控
2
达，影响Caspase蛋白的产生。
Caspase的翻译后修饰，如磷酸化和乙酰
化，可以调控其活性和稳定性。
3
活性调控
通过蛋白激酶、抑制剂和结合蛋白的调 控，控制Caspase的活性和水平。
Caspase的信号通路
1
Hale Waihona Puke Caspase-8信号通路
Caspase-8通常参与由死受体复合体(DRC)激活的细胞凋亡信号通路。
2
Caspase-9信号通路
Caspase-9是线粒体介导的细胞凋亡信号通路中的关键成分。
Caspase在细胞凋亡中的作用
1 Caspase在凋亡信号通路中的地位
Caspase蛋白在细胞凋亡信号通路中起到重要的调节和执行作用。
2 Caspase的活化与废弃作用
Caspase蛋白的活化和废弃作用是细胞凋亡的关键步骤。
Caspase的分类
根据结构分
• 主要分为Caspase-1家族和Caspase-3家族。 • 每个家族包含多个亚型，具有不同的底物特
异性。
根据功能分
• 活化Caspase：负责激活其他Caspase蛋白。 • 废弃Caspase：负责降解细胞内的关键蛋白，
触发细胞死亡。
caspase家族
细胞色素c
Caspase-8酶原 活化的 Caspase-8 CARD Caspase-9酶原 活化的 Caspase-3 活化的 Caspase-9 Apaf-1
Caspase-3酶原
凋亡复合体
切割底物，产生效应
细胞凋亡的膜受体通路
FASL+FAS +FADD
凋亡诱导复合物（DISC） 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上 细胞有足够caspase8 死亡受体活化， 细胞凋亡 细胞caspase8浓度不够 切割Bid tBid从胞质到线粒体 CtyC 释放
未活化的caspase 酶原Y
原结构域
活化的caspaseX
较多活化的caspaseY
大量活化的caspaseZ
切割细胞质蛋白
切割细胞核蛋白
外源途径 内源途径 其他刺 激因素
Fas DD FADD
Fas DD + DD DED
Fas
Fas DD DED DISC切的Bid
2002年诺贝尔医学及生理学奖
凋亡起始者 Caspase 9、8、2、10、11
同性活化——切割自身前体
凋亡执行者 Caspase 3、6、7
异性活化——切割结构蛋白、功能蛋白
Caspase级联效应
NH2 活化的 caspase X
大亚基
切割位点
小亚基 切割活化 COOH 活化的 caspase Y
Caspase 家族
及其在细胞凋亡中的作用
Caspase （天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶）
是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白
酶，它们的活性位点均包含Cys残基，能够特异 性的切割靶蛋白Asp残基后的肽键。Caspase能 选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。
Caspase的活化及其在细胞凋亡中的作用
当细胞受到某些刺激时，线粒体释放出促凋亡因子，如 Bcl-2家族的成员，这些因子会激活Caspase-9，进而激活 下游的Caspase，引发细胞凋亡。
内质网途径
当内质网应激时，会释放出Ca2+和活性氧，这些物质会 激活Caspase-12，进而引发细胞凋亡。
04 Caspase活化的研究方法
Caspase的活化及其在细胞凋亡 中的作用
目 录
• 引言 • Caspase的概述 • Caspase在细胞凋亡中的作用 • Caspase活化的研究方法 • Caspase活化与疾病的关系 • 展望与未来研究方向
01 引言
研究背景
细胞凋亡是生物体内一种重要的生理过程，它涉及到一系列复杂的分子事件和信 号转导途径。Caspase是一类在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶，其活化是 细胞凋亡的标志之一。
细胞凋亡的概述
01
细胞凋亡是细胞自我消亡的过程，是机体正常发育和维持内环 境稳定的重要机制。
02
细胞凋亡是由基因控制的程序性死亡，涉及一系列复杂的生化
反应。
细胞凋亡过程中，细胞膜保持完整，不会引起周围组织的炎症
03
反应。
Caspase在细胞凋亡中的角色
01
Caspase是一类蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作 用。
当死亡受体（如Fas或TNFR）与其配体结合后，会募集并活化Caspase-8，引发细胞凋亡。
线粒体途径
当细胞受到某些刺激时，线粒体释放凋亡因子（如Cytochrome c），与Caspase-9前体结合 形成复合物，激活Caspase-9，进而活化效应Caspase引发细胞凋亡。
03 Caspase在细胞凋亡中的 作用
caspase
摘要内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。
人血管内皮细胞（EC）营养剥夺引起的非常规分泌导致nanovesicles不同于凋亡小体的多泡体标记和承载释放形式（MVB）。
营养的缺乏也是一个有效的诱导的自噬小泡运输途径可以帮助细胞自噬。
营养缺乏引起的一个显着和自噬功能的迅速增加，通过电子显微镜和免疫印迹分析LC3-II / LC3-I比成像。
增加自噬通量在血清饥饿细胞巴弗洛霉素A确认1。
诱导的自噬后的凋亡反应的指标，如通过显微镜和聚（ADP-核糖）评估在细胞膜通透性的指示坏死缺失聚合酶裂解。
与zvad-fmk泛caspase抑制并没有阻止细胞自噬的发展而受到负面影响自噬泡（AV）成熟。
采用免疫印迹法验证多维蛋白质组学的方法，我们确定营养剥夺EC释放AV组件（lc3i，LC3-II，ATG16L1和LAMP2）而zvad-fmk 泛caspase抑制剂阻断AV释放。
同样，在主动脉的小鼠EC营养剥夺的分离研究/半胱天冬酶3-缺失的小鼠没有凋亡自噬LC3和未能迅速释放。
总的来说，本研究结果表明，自噬成分释放的营养剥夺细胞凋亡的人类细胞的细胞膜通透性的缺失。
这些结果也确定caspase-3作为一种新型的AV释放器。
关键词自噬，自噬，caspase的激活，caspase-3，营养剥夺，非常规分泌说明内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。
响应于各种细胞应力是免疫或非免疫内皮细胞凋亡是血管疾病最关键。
凋亡细胞的凋亡小体膜结合主动释放来自皱缩，细胞膜。
1，2我们最近证明，除了膜起泡，非常规形式的分泌在人类凋亡激活的内皮细胞（EC）导致纳米囊泡的生化和功能不同的凋亡小体的多泡体标记和承载释放（MVB）。
3泛半胱天冬酶失活或小干扰靶向研究显著降低凋亡细胞释放的MVB成分RNA。
然而，MVB成分释放被描述在一个实验中，在人类EC敏锐地剥夺生长因子，一个经典的促凋亡刺激，但也是一种有效的诱导细胞自噬。
Caspase
Caspase生化特性caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶，一般在细胞内以无活性酶形式存在；当其作用于特异性底物，产生异二聚体，同时发出光子。
Caspase检测凋亡的原理通过检测细胞内caspase酶活性了解细胞的凋亡功能。
试剂渗透进入细胞后，使细胞内caspase 酶释放，作用于其特异性底物，产生发光体或荧光，发光酶（荧光酶）作用于发光体，产生光。
发光度与细胞内caspase酶活性成正比。
Caspase酶活性反映了细胞内凋亡途径激活情况，即细胞的凋亡能力。
如何做对照组？阴性对照：caspase抑制剂和培养基；或者只加完全培养基。
试剂盒没有caspase抑制剂？不必要。
Caspase试剂盒组成：caspase3/7特异性底物；含发光酶，细胞溶解液的缓冲液。
Caspase试剂盒分类：caspase3/7,caspase8,caspase9.(后两个是内源性凋亡途径参与物）试剂盒的选择：一般细胞凋亡检测选用caspase3/7试剂盒，如果用于分析凋亡上游启动子，根据对凋亡途径（内源性/外源性）的兴趣，选择caspase8/caspase9试剂盒即可。
Caspase3/7介绍Caspase3/7是一种发光分析法，可用于检测粘附细胞或悬浮生长细胞内caspase3/7的酶活性。
试剂盒中包含了发光前体caspase3/7的Z-DEVD-aminoluciferin 冻干底物，DEVD为抑制剂，保证了试剂盒的特异性。
底物被切割后产生发光体，发光体作为发光酶的底物与之反应后，发出光。
Caspase3/7试剂已经对caspase酶活力，发光酶活力以及细胞溶解做了优化。
将试剂以混合物形式加入样本，导致细胞溶解，底物的切割和产生流性光信号。
可用于研究细胞凋亡和凋亡抑制。
实验大概需用2小时一轮。
检测波长一般检测发光体没有内置的波长选择功能，都采用全部可见光检测。
原因有二：1.不需用滤光；2.滤光后敏感度降低。
内源性凋亡途径：病毒，紫外线或线粒体胞膜破坏，细胞色素C释放至胞液等因素导致内源性凋亡途径激活，从而产生含有caspase-9前体的凋亡小体复合物，复合物导致caspase-9活化，接着caspase-9使下游介导凋亡的死亡效应caspase酶活化，包括caspase3,caspase6,caspase7。
Caspase 3活性检测
Caspase 3 活性检测试剂盒产品组成：产品组成 BB-4106-1 BB-4106-2 BB-4106-3规格 20 assays 50 assays 100 assays 裂解缓冲液 5ml 10ml 15mlAc-DEVD-p NA 200ul 500ul 1ml检测缓冲液 5ml 10ml 15mlDTT 100ul 150ul 250ul产品简介：Caspase 3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase 底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。
同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。
本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。
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Caspase生化特性
caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶，一般在细胞内以无活性酶形式存在；当其作用于特异性底物，产生异二聚体，同时发出光子。
Caspase检测凋亡的原理
通过检测细胞内caspase酶活性了解细胞的凋亡功能。
试剂渗透进入细胞后，使细胞内caspase 酶释放，作用于其特异性底物，产生发光体或荧光，发光酶（荧光酶）作用于发光体，产生光。
发光度与细胞内caspase酶活性成正比。
Caspase酶活性反映了细胞内凋亡途径激活情况，即细胞的凋亡能力。
如何做对照组？
阴性对照：caspase抑制剂和培养基；或者只加完全培养基。
试剂盒没有caspase抑制剂？
不必要。
Caspase试剂盒组成：caspase3/7特异性底物；含发光酶，细胞溶解液的缓冲液。
Caspase试剂盒分类：caspase3/7,caspase8,caspase9.(后两个是内源性凋亡途径参与物）
试剂盒的选择：
一般细胞凋亡检测选用caspase3/7试剂盒，如果用于分析凋亡上游启动子，根据对凋亡途径（内源性/外源性）的兴趣，选择caspase8/caspase9试剂盒即可。
Caspase3/7介绍
Caspase3/7是一种发光分析法，可用于检测粘附细胞或悬浮生长细胞内caspase3/7的酶活性。
试剂盒中包含了发光前体caspase3/7的Z-DEVD-aminoluciferin 冻干底物，DEVD为抑制剂，保证了试剂盒的特异性。
底物被切割后产生发光体，发光体作为发光酶的底物与之反应后，发出光。
Caspase3/7试剂已经对caspase酶活力，发光酶活力以及细胞溶解做了优化。
将试剂以混合物形式加入样本，导致细胞溶解，底物的切割和产生流性光信号。
可用于研究细胞凋亡和凋亡抑制。
实验大概需用2小时一轮。
检测波长？？？
一般检测发光体没有内置的波长选择功能，都采用全部可见光检测。
原因有二：1.不需用滤光；2.滤光后敏感度降低。
内源性凋亡途径：
病毒，紫外线或线粒体胞膜破坏，细胞色素C释放至胞液等因素导致内源性凋亡途径激活，从而产生含有caspase-9前体的凋亡小体复合物，复合物导致caspase-9活化，接着caspase-9使下游介导凋亡的死亡效应caspase酶活化，包括caspase3,caspase6,caspase7。
The
Caspase-Glo® 9 Assay 试剂盒就检测细胞内产生的内源性caspase9。
外源性凋亡途径：
受体介导或者死亡受体超家族的肿瘤坏死因子交叉反应，产生死亡诱导信号复合物（DISC），其中包含具有自我催化能力的caspase-8蛋白酶，caspase-8进一步作用后，活化下游死亡效应caspase酶，包括caspase3,caspase6,caspase7。
导致结构片段降解或者修复酶。
The Caspase-Glo® 8 Assay试剂盒用于检测活化的caspase-8。
摸索：
处理后分析的最佳时间点；
目前关键是：检测光的仪器。