第7章 亲和层析
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第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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06.05.2021
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
06.05.2021
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
06.05.2021
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
06.05.2021
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
海南大学农学院wss39
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
第7章 亲和层析
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第七章 亲和层析
Teaching and Rese
arch Section ·
Department of
Biochemical
Engineering
19
7.2.4 配体的选择
7.2.4.2 配体的类型 •通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，
•如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分 子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。
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第七章 亲和层析
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• 疏水性连接臂会对样品产生非特异性吸附，若非必 要，应尽量避免接入连接臂，或选择可自动引入连 接臂的活化方法，或选择接好连接臂的商品化载体 。
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第七章 亲和层析
赵世光 生物化学工程系·生物技术教研室
第一节 概述
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Engineering
层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定
第七章层析
tR′ = tR - t0 ⑥校正保留体积VR′ 扣除死体积后的保留体积称为校
正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：
VR′ = VR–V0
VR′与tR′之间的关系为：
VR′ = tR′ Fc
死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性
质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积
VR′，将更合理地反映被测组分的保留特点。
第一节 层析的基本原理及分类
2．阻滞因数或比移值Rf
在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移 动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：
R f 溶 质 （ 流 浓 动 度 相 中 的 心 移 ） 动 的 速 移 度 动 速 度 在 同 溶 一 质 时 （ 间 浓 流 度 动 中 相 心 前 ） 沿 的 的 移 移 动 动 距 距 离 离 ( r ) ( R )
分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素
对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。
第一节 层析的基本原理及分类
根据分离度R的大小可 以判断被物质在色谱柱中
的分离情况；R值越大，两
色谱峰的距离越远，分离 效果就越好，如图7-5所示。 当R<1时，两峰有部分重叠； 当R = 1时，两峰有98%的 分离；当R = 1.5时，分离 程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分 离的标志。
第一节 层析的基本原理及分类
2．固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸 层 析 法 ( Paper chromatography)、 薄 层 层 析 法 ( Thin—1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)。纸层 析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于 大量制备分离，是主要的层析分离手段。
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
第七章亲和层析
三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B
第七章亲和层析
• Sepharose • 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；
• 它基本上能符合理想基质的五点要求； • 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的
基团； • 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大
第七章亲和层析
2．偶联 配体和基质充分偶联而形成固相载体。 经活化和洗涤过的基质与等体积的0.2~0.25mol／L碳 酸盐缓冲液(含0.5mol／LNaCl和1~10pmol配体／ml基 质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或 过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。
分子物质，且吸附容量也较大； • 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械
强度比Sepharose 2B好。
因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种 基质。
第七章亲和层析
二、配体的选择 可选择的配体有：
抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金 属离子)等。
• 另将称量的固体CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。
• 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的预冷 水及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。
通过活化反应形成的化合物可能有两种： • 其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物； • 其二是无反应能力的氨基碳酸盐。
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• Sepharose • 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；
• 它基本上能符合理想基质的五点要求； • 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的
基团； • 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大
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2．偶联 配体和基质充分偶联而形成固相载体。 经活化和洗涤过的基质与等体积的0.2~0.25mol／L碳 酸盐缓冲液(含0.5mol／LNaCl和1~10pmol配体／ml基 质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或 过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。
分子物质，且吸附容量也较大； • 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械
强度比Sepharose 2B好。
因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种 基质。
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二、配体的选择 可选择的配体有：
抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金 属离子)等。
• 另将称量的固体CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。
• 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的预冷 水及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。
通过活化反应形成的化合物可能有两种： • 其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物； • 其二是无反应能力的氨基碳酸盐。
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
亲和层析原理和步骤
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
载体
实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
KL：解离常数 E： 酶
L： 底物
E+L
KL
EL
EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
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2016/2/17 14
第二节
一、理想基质的性质
1.
操作
结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透；
2.
颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化 不引起变形；
物理化学性质稳定； 化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附； 带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体；
3. 4. 5. 6. 7.
36
EDTA(10mmol/L)用以稳定蛋白质中能被重金属催 2016/2/17 化氧化的－SH基。
3.柱操作
选用柱的大小依据a.吸附剂的容量；b.需要纯化
的蛋白质的量。
由于亲和原理，可分离的容量大。样品量可达 总体积只需1～5ml。
1 2
柱体积。为提高分离效率，一般选用粗、短柱。
若靶蛋白是较低的结合常数﹥10-4/M可用较长的 柱，结合较牢、结合常数＜10-13 /M则选用短柱。
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素
抗生物素蛋白 2016/2/17
含生物素的酶
糖
凝集素、糖苷酶
23
2016/2/17
24
三、亲和吸附剂的制备
一般用CNBr衍生载体的功能基 团，产生的亲电基团可以同配 体的亲核基团（-NH2,-SH，－ OH）反应。或者相反。 用物理与化学的方法把配体偶 联到基质上。化学偶联法是通 过配体对活化的载体材料进行 亲核攻击实现的.
第七章
亲和层析
Affinity chromatography
2016/2/17
1
技术背景
一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方
法的主要依据是，各种大分子之间理化特 性的差异性。
如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍
高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作， 耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。
2016/2/17 2
们之间的亲和力有
密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
2016/2/17
33
五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤
凝胶与配体偶联
装柱操作
流速控制
柱子平衡
洗脱方法
淋洗
洗脱目标样品
柱子再生
2016/2/17
34
1.样品制备
除去颗粒、细胞碎片、膜片段等； 样品的浓缩、除去蛋白酶及其抑制剂； 可以通过盐析方法沉淀杂蛋白或离子交换 层析法对样品进行预处理。
2016/2/17
35
2.结合吸附条件
目标蛋白质对配体的特异性结合需要最适合的 pH、 缓冲液盐浓度、离子强度、温度。pH起着调节目 标蛋白质分子以及配体分子的电荷基团性质的作 用。
中等盐浓度（0.1～0.15mol/L NaCl）可以稳定溶 液中的蛋白质并防止非特异性的作用。
高盐浓度（2mol/L(NH4)2SO4）能特异性地提高配 体和靶蛋白的疏水作用。
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 13 子样品。
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17
28
不同活化剂活化载体的偶联条件
活化载体 溴化氰活化载体 温度/℃ pH值 4 9.5 9.5 9.5 时间/h 24 24 30
环氧氯丙烷活化载体 40 1,4-丁二醚活化载体 45
2016/2/17
29
用溴化氰活化载体
2016/2/17
30
2016/2/17
31
四、特异性吸附
2016/2/17 21
专一性结合的生物体系
常用配体
酶蛋白 抗 体
分离对象
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白 互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
外源凝集素 核 酸
激素及维生素
2016/2/17
细
胞
细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
2016/2/17 37
4. 柱流速的控制
在概念上，亲和层析的流速比较快，要求不严格。
但为了使纯化的蛋白质能得到尖的洗脱峰和最小
的稀释度及最大的回收率。故上样品时使用低流
速。 A.太高的流速会降低分离效果和容量； B.用可溶性配体/类似物进行竞争性洗脱时，解离动 力学可能成为速率限制；
C.亲和柱的线性流速需进行优化达到最大的结合容
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合量较强 时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入， 亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密 的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。 影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有 关。例：P120
复合物带
2016/2/17
32
样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它
22
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体
抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体 特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
配体
肝素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA聚 合酶 胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白
2016/2/17
7
■ 亲和层析法的作用机理：
X
A (1) B A (2) (3) A
Washing
Elution
Sample
B 亲和基团 配体
固相载体 2016/2/17
X
B
8
2016/2/17
9
特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层 析法：
方法 特异性配体亲和 层析法 配体 性能
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
2016/2/17
量和最佳的分离。
38
5.洗脱方法
2016/2/17
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大体积的平衡缓冲液洗脱亲和力较小的分子； 亲和力稍大时，线性梯度、阶梯分步洗脱；
可改变pH、离子强度实现非特异性的竞争，解吸已结合 的分子；
对亲和力特别大的复合物，除用高浓度的可溶性配体洗 脱外，还需6mol/L盐酸胍、pH1.5，使复合物在合理的 时间内解离。并不破坏靶蛋白的天然构象及生物活性。 以及洗脱后的除盐。
Elution volume
12
亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品
亲和层析法
利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应 性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定 相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保 留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以 2016/2/17 6 纯品形态洗脱下来。
①用NaCl梯度洗脱特异的静电作用结合的蛋白质； ②疏水结合的复合物，加入乙二醇降低水溶液的极性；
高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合；
抗微生物和酶的侵蚀。
15
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具有实用价值的基质
纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪 氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百 倍。 但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非 专一性吸附。 葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结 构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用 受限制。 聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀 , 可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。 适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但不易 2016/2/17 16 引入间隔臂，受到限制。
2016/2/17
3
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17 4
第一节 基本原理
M L S
蛋白质2与配体无 生物学特异性
1
2
2016/2/17
5
亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识 别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
载体的活化
配体的偶联
测定配体结合量，每mL或每g 载体束缚配体的量mg （mg/mL）。一般用直接法和 间接法测定。2016/2/17源自结合能力的测定25
测定方法
活化剂种类
溴化氰（CNBr） 环氧氯丙烷 1,4-丁二醚 戊二醛 高碘酸盐
2016/2/17
26
常见几种活化剂的活化条件
2.配体的分类
单特异性配体：只结合一个或很小数量的蛋白质，识别 小分子的局限性强，甾体激素和酶抑制剂属于此类配体。 大分子单特异性配体：抗体－抗原结合是大分子单特异 性配体及其目的蛋白的最重要的例证。 组特异性配体（通用性配体）：是指一类像辅酶、维生 素/辅因子或它们的类似物，它们可以同几种不同蛋白 的共同位点相结合。是识别一类小分子物质的配体。 大分子组特异性配体:是识别一类大分子物质的配体。 凝集素和一些免疫球蛋白结合蛋白、伴刀豆球蛋白与糖 蛋白结合等。
第二节
一、理想基质的性质
1.
操作
结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透；
2.
颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化 不引起变形；
物理化学性质稳定； 化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附； 带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体；
3. 4. 5. 6. 7.
36
EDTA(10mmol/L)用以稳定蛋白质中能被重金属催 2016/2/17 化氧化的－SH基。
3.柱操作
选用柱的大小依据a.吸附剂的容量；b.需要纯化
的蛋白质的量。
由于亲和原理，可分离的容量大。样品量可达 总体积只需1～5ml。
1 2
柱体积。为提高分离效率，一般选用粗、短柱。
若靶蛋白是较低的结合常数﹥10-4/M可用较长的 柱，结合较牢、结合常数＜10-13 /M则选用短柱。
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素
抗生物素蛋白 2016/2/17
含生物素的酶
糖
凝集素、糖苷酶
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24
三、亲和吸附剂的制备
一般用CNBr衍生载体的功能基 团，产生的亲电基团可以同配 体的亲核基团（-NH2,-SH，－ OH）反应。或者相反。 用物理与化学的方法把配体偶 联到基质上。化学偶联法是通 过配体对活化的载体材料进行 亲核攻击实现的.
第七章
亲和层析
Affinity chromatography
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1
技术背景
一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方
法的主要依据是，各种大分子之间理化特 性的差异性。
如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍
高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作， 耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。
2016/2/17 2
们之间的亲和力有
密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
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五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤
凝胶与配体偶联
装柱操作
流速控制
柱子平衡
洗脱方法
淋洗
洗脱目标样品
柱子再生
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1.样品制备
除去颗粒、细胞碎片、膜片段等； 样品的浓缩、除去蛋白酶及其抑制剂； 可以通过盐析方法沉淀杂蛋白或离子交换 层析法对样品进行预处理。
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2.结合吸附条件
目标蛋白质对配体的特异性结合需要最适合的 pH、 缓冲液盐浓度、离子强度、温度。pH起着调节目 标蛋白质分子以及配体分子的电荷基团性质的作 用。
中等盐浓度（0.1～0.15mol/L NaCl）可以稳定溶 液中的蛋白质并防止非特异性的作用。
高盐浓度（2mol/L(NH4)2SO4）能特异性地提高配 体和靶蛋白的疏水作用。
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 13 子样品。
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
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不同活化剂活化载体的偶联条件
活化载体 溴化氰活化载体 温度/℃ pH值 4 9.5 9.5 9.5 时间/h 24 24 30
环氧氯丙烷活化载体 40 1,4-丁二醚活化载体 45
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用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
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专一性结合的生物体系
常用配体
酶蛋白 抗 体
分离对象
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白 互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
外源凝集素 核 酸
激素及维生素
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细
胞
细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
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4. 柱流速的控制
在概念上，亲和层析的流速比较快，要求不严格。
但为了使纯化的蛋白质能得到尖的洗脱峰和最小
的稀释度及最大的回收率。故上样品时使用低流
速。 A.太高的流速会降低分离效果和容量； B.用可溶性配体/类似物进行竞争性洗脱时，解离动 力学可能成为速率限制；
C.亲和柱的线性流速需进行优化达到最大的结合容
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合量较强 时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入， 亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密 的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。 影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有 关。例：P120
复合物带
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样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它
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蛋白质亲和层析中的合适配体
配体
抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体 特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
配体
肝素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA聚 合酶 胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白
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■ 亲和层析法的作用机理：
X
A (1) B A (2) (3) A
Washing
Elution
Sample
B 亲和基团 配体
固相载体 2016/2/17
X
B
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特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层 析法：
方法 特异性配体亲和 层析法 配体 性能
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
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量和最佳的分离。
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5.洗脱方法
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大体积的平衡缓冲液洗脱亲和力较小的分子； 亲和力稍大时，线性梯度、阶梯分步洗脱；
可改变pH、离子强度实现非特异性的竞争，解吸已结合 的分子；
对亲和力特别大的复合物，除用高浓度的可溶性配体洗 脱外，还需6mol/L盐酸胍、pH1.5，使复合物在合理的 时间内解离。并不破坏靶蛋白的天然构象及生物活性。 以及洗脱后的除盐。
Elution volume
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亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品
亲和层析法
利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应 性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定 相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保 留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以 2016/2/17 6 纯品形态洗脱下来。
①用NaCl梯度洗脱特异的静电作用结合的蛋白质； ②疏水结合的复合物，加入乙二醇降低水溶液的极性；
高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合；
抗微生物和酶的侵蚀。
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具有实用价值的基质
纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪 氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百 倍。 但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非 专一性吸附。 葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结 构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用 受限制。 聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀 , 可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。 适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但不易 2016/2/17 16 引入间隔臂，受到限制。
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
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第一节 基本原理
M L S
蛋白质2与配体无 生物学特异性
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亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识 别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
载体的活化
配体的偶联
测定配体结合量，每mL或每g 载体束缚配体的量mg （mg/mL）。一般用直接法和 间接法测定。2016/2/17源自结合能力的测定25
测定方法
活化剂种类
溴化氰（CNBr） 环氧氯丙烷 1,4-丁二醚 戊二醛 高碘酸盐
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常见几种活化剂的活化条件
2.配体的分类
单特异性配体：只结合一个或很小数量的蛋白质，识别 小分子的局限性强，甾体激素和酶抑制剂属于此类配体。 大分子单特异性配体：抗体－抗原结合是大分子单特异 性配体及其目的蛋白的最重要的例证。 组特异性配体（通用性配体）：是指一类像辅酶、维生 素/辅因子或它们的类似物，它们可以同几种不同蛋白 的共同位点相结合。是识别一类小分子物质的配体。 大分子组特异性配体:是识别一类大分子物质的配体。 凝集素和一些免疫球蛋白结合蛋白、伴刀豆球蛋白与糖 蛋白结合等。