农杆菌介导棉花转基因的方法
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系（一）实验方法以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。
嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接穗是转化基因再生植株。
（二）实验步骤农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。
1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干；2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白；3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上，28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养(D/N＝16 h/8 h) 3 d。
4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。
在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。
平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。
4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。
然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。
转基因步骤
农杆菌诱导的棉花下胚轴遗传转化1:无菌苗的制备a：现将准备好的棉花种子去掉外面的硬壳，在超净工作台上用0.1%的升汞灭菌8分钟（期间不断的摇晃小三角瓶）。
将升汞倒回原来的瓶子后，用无菌水清洗3－4次，5min左右一次（清洗的期间不断地摇晃小瓶子）。
b：清洗完毕后，将种子转移到无菌培养基上，5—6颗每瓶（在转移时，所用到的勺子，镊子注意用酒精灯烧好，注意无菌操作）。
c：将已经转移好的培养基封口后，放入恒温培养箱培养。
d：恒温培养箱培养48h后扶苗（扶苗主要是将种皮去掉，将已经长出来的跟插入到培养基里面）。
e：96h后根据下胚轴生长情况切苗转化。
注意：上述全部过程都是在超净工作台上完成的，注意各个细节确保无菌操作。
需要准备的器具有无菌水，两个灭菌的空瓶子，升汞，镊子，无菌培养基，酒精灯，种子。
2:切苗转基因a：准备好需要的器具，两个带滤纸的大皿，带滤纸和不带滤纸的小皿数个，两把镊子，酒精灯。
b：切苗的要求，将生长正常无菌的下胚轴从无菌培养基上取出来去掉两端多余的部分，用已经灭菌的刀片将其切成6-8 mm的小段，在切得时候要做到一刀两段，不能用刀片将下胚轴损伤。
C：在切了一半的时候可以准备要用的菌液（假设同时转两个基因，只用一瓶菌液）1：取10ml MGL到三角瓶之中分别加入25ulAS2：将已经准备好的菌液取适当的量到离心管中，离心一分钟后待菌体沉积到离心管底部时即可。
3:将需要转化的基因在三角瓶上编号，用MGL抽打菌液后，取少量菌液转入到不同基因的三角瓶内（在光下看到溶液为薄雾状即可）。
4：将带有编号的三角瓶放到摇床上>30min5:将菌种转入到4摄氏度的冰箱中保存。
6：待切苗完成后，将下胚轴转入到对应的菌液中，8min后倒掉菌液，待下胚轴上的菌液完全干之后（可用小皿里的小滤纸反复吸收上面的菌液)，将下胚轴转入到带有小滤纸的共培养。
的培养皿中。
将转好的小培养皿放到恒温培养箱中，72h后转皿。
棉花转基因技术的研究及应用
棉花 的基 因组 中并 得 以表 达 ， 且外 源 Ｄ Ａ表 达 通 常 Ｎ 表现 出典 型 的 孟 德 尔 遗 传 规 律 。 由 于 Ｔ 质 粒 本 身 ｉ
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在棉 花 遗 传 转 化 体 系 中 ， 要 有 农 杆 菌 介 导 主
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关键词 ： 棉花 ； 遗传 转化 ； 究与应用 研
中 图 分 类 号 ：５２０ ￥６ ．１ 文 献 标识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：００— ０ １２０ ） 刊 一 ０ １ ０ １０ ７ ９ （０６ 增 ０４ — ５
棉花转化实验报告
棉花转化实验报告棉花转化实验报告一、引言棉花是世界上最重要的经济作物之一，广泛用于纺织品、纸张和食品工业。
然而，传统棉花种植面临着许多挑战，如病虫害、环境压力和耕地资源有限等。
因此，寻找一种高效的棉花转化方法，以提高产量和抗性，对于农业发展具有重要意义。
二、材料与方法本实验选取了常见的棉花品种作为研究对象，通过基因转化技术引入外源基因，以提高棉花的产量和抗性。
具体步骤如下：1. 构建转化载体：将目标基因与转化载体连接，构建出适合棉花转化的载体。
2. 组织培养：采集棉花幼胚作为外植体，在含有适当激素的培养基中进行愈伤组织的诱导和增殖。
3. 基因转化：将构建好的转化载体通过农杆菌介导法导入棉花愈伤组织细胞中，利用细胞的再生能力使转基因棉花植株产生。
4. 筛选转基因植株：通过对转基因植株进行筛选，利用PCR等方法检测目标基因是否成功转化。
5. 鉴定转基因植株：通过观察转基因植株的形态特征、生长情况和抗性等性状，对转基因棉花进行鉴定。
三、结果与讨论经过一系列的实验操作，我们成功地将外源基因导入了棉花植株中，并获得了转基因棉花。
通过PCR分析，我们确认了目标基因的存在。
在鉴定转基因棉花的过程中，我们观察到转基因植株在生长速度、花期和产量等方面均表现出了显著的改善。
同时，转基因棉花还表现出更好的抗虫性和耐逆性，对病虫害的抵抗能力明显增强。
这一实验结果表明，通过基因转化技术可以有效地提高棉花的产量和抗性。
转基因棉花具有广阔的应用前景，可以为农业生产带来诸多益处。
然而，我们也应该注意到转基因技术的潜在风险和争议。
在推广应用转基因棉花之前，需要进行更多的安全性评估和环境影响研究，以确保其对人类和环境的安全性。
四、结论本实验通过基因转化技术成功地将外源基因导入棉花植株中，获得了转基因棉花，并证实了转基因棉花在产量和抗性方面的优势。
这一研究为棉花种植的发展提供了新的思路和方法。
然而，转基因技术的应用仍需要更多的研究和评估，以确保其安全性和可持续性。
棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立和GLU-CHI基因的导入
棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立和GLU-CHI基因的导入棉花是世界重要的经济作物之一，但是由于长期受到黄萎病的危害，其产量和品质受到严重影响。
目前，通过常规育种方式来寻找合适的抗源尚存在困难。
因此，利用基因工程进行遗传改良的研究一直倍受人们关注。
本实验以川棉239和川棉45的茎尖为材料，建立起良好的再生体系和基因枪—农杆菌转化体系。
并把玉米几丁质酶基因和大麦β-1，3-葡聚糖酶基因的双价表达载体导入棉花，获得了抗卡那霉素的转基因棉花新材料，主要结果如下： 1．棉花茎尖再生体系的建立取1.5d苗龄的茎尖，接入MSB<sub>1</sub>（MSB+BA0.1mg/L）中培养2-3周，然后转入MSB<sub>2</sub>（MSB+活性炭lg/L）中培养2-3周，再转入MSB<sub>3</sub>（MSB+IBA 0.1mg/L+IAA0.1mg/L）中培养2周，再在1/2MSB上培养2-4周。
两个品种的再生频率达90％以上。
2．Kan筛选压的确定取1.5d苗龄的棉花茎尖，置于附加不同浓度（0、10、20、30、40、50、75、100mg/L）Kan的MSB<sub>1</sub>（MSB+BA 0.1mg/L）培养基中进行Kan敏感性测试，确定了筛选压浓度为：Kan 50mg/L。
3．棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立取1.5d苗龄的茎尖，用钨弹轰击形成创伤，轰击距离为3cm，轰击压力为1550psi，真空度27-28 inches Hg（负压）。
然后用OD<sub>6</sub>00值为1.1的农杆菌菌液（内含100mg/L乙酰丁香酮）抽真空感染30min，真空度为25 inches Hg。
转入表面附加有一层滤纸的MSB<sub>1</sub>+AS 100mg/L的培养基上28℃、暗处共培养3d后，将外植体转入延迟筛选培养基（MSB<sub>1</sub>+Cef500mg/L）中培养7d。
转基因棉花灭虫的原理
转基因棉花灭虫的原理一、转基因棉花的制作
1. 选择具有抗虫基因的捕食性细菌,提取此基因。
2. 使用热坏血酸杆菌作为载体,构建重组质粒。
3. 将重组质粒导入棉花组织,利用农杆菌介导的基因转化。
4. 在选择性培养基上长出转基因植株,获得转Bt基因棉花。
二、Bt基因蛋白的作用
1. Bt基因来源于土壤芽孢杆菌,可编码生产Bt蛋白。
2. Bt蛋白可降解为δ内酰胺,对鳞翅目昆虫具有高毒性。
3. 棉花生产Bt蛋白,使叶子、茎、棉絮中都含有这种蛋白质。
三、转基因棉花抗虫的机制
1. 鳞翅目虫幼虫取食转基因棉叶、茎时,会摄入Bt蛋白。
2. Bt蛋白在虫肠道被激活,破坏肠道细胞,导致虫体死亡。
3. 转基因棉种植可大幅减少使用农药,有效控制虫害。
四、转Bt基因棉花的优点
1. 对目标害虫具有高letal效应,防治效果好。
2. 可大幅减少农药使用,减轻环境负担。
3. 对人畜安全,Bt蛋白不溶于水,不会残留。
4. 种植管理简便,产量和质量较高。
五、注意事项
1. 要监控目标害虫,防止抗药性的产生。
2. 避免影响到非目标生物,保护生态环境。
3. 制定科学合理的种植计划和技术措施。
4. 加强转基因棉监管,确保食品安全。
农杆菌法转化茎尖获得转SNC1基因棉花及其T_1植株对棉花枯萎病的抗性
Ｍ ｏｅ ｕ ａ ｌｎ ｅ ｄ ｎ ， ０１ ， １ ， ．， ５ — ５ ｌ ｃ ｌｒ ａ ｔ Ｐ Ｂｒ ｅ ｉ ｇ ２ Ｖｏ ． Ｎｏ２ ２ ２ ２ ８ ０ ８
研究报告
Ａ ｔ ｒ Ｌｅｔ ｅ
Ｌｅ ｉｎ ｒ ｎ Ｗ ａ ｇ Ｄｏ ｇ ｅ ’ Ｓ ａ ｎ Ｗ ｅ ａ ｗｅ Ｈｕ ｎｇＬｅ ｉ ｇ ｉＪａ ｇ ｏ ｇ ｎ ｎｍ ｉ ｈ ｏＬｉ ｉＸｉ ｏ ｉ ａ ｐｎ
Ｔ ｅＩｓｉ ｔｏ Ｎｕ ｌ ｒ ｎ ｏｏ ｉａＴ ｃｎ ｌｇ ， ｎｉｎ ａｅ ｆ ｇｉ ｌ ｒｌ ｃｅｃｓＵｒｍｑ，３ ０ １ ｈ ｔｕｅ ｆ ｃｅ ｄ ｌｇｃｌ ｅｈ ｏｏ ｙＸｉ ａｇ ｎ ｔ ａ ａ Ｂｉ ｊ Ａｃｄｍｙｏ Ａ ｒ ｕｔ ａ ｉ ｅ， ｕ ｉ８０ ９ ｃ ｕ Ｓ ｎ
照 比较 ， Ｔ 代转基 因棉花 的枯 萎病抗性 明显提高 。 关 键词 Ｓ １ 农 杆菌 介导法 ， ＮＣ ， 茎尖 ， 陆地 棉， 萎病 枯
Ａｇ ｏ ｕ ｍｅ ｉｔｄ Ｔ ａ ｓｏ ｍ ａｉ ｎ ｏ ＮＣ ｎ ｎ ｏ Ｃｏ ｔ ｎ Ｓ ｏ ｔ ｒ ｂ ｃ ｅ ｉｍ— ｄ ａｅ ｒ ｎ ｆ ｒ ｔ ｆＳ １ Ｇｅ ｅ ｉ ｔ ｔ ｈ ｏ ａ ｔｒ ｏ ｏ Ａｐ ｘ ａ ｄＦ ｓ ｒｕ Ｗ ｉ ｓｓａ ｃ ｌｎ ｓ ｅ ｎ ｕ ａ ｉ ｍ ｌ Ｒｅ ｉ ｎ ｅｉ Ｔ１ ａ ｔ基因棉花及其 Ｔ 植株对棉花枯萎病的抗性 Ｎ１
雷江荣 王 冬梅 邵 林 危晓薇 黄 乐平
新疆农业科学院核技 术生物技术研究所， 乌鲁木齐， ３０ １ ８ ０９ 通讯作者． ｍ０ ２ ＠ｙｈ ｏＣｒ． ｗｄ １ １ ａｏ ． ｕ ｃ Ｏ ｎ
摘 要 以陆地 棉 中 ３ ５和 军棉 １号的茎尖 为外植体 ，利用农杆 菌介 导法将 含有拟 南芥抗病 基 因 Ｓ １（ ｐ ＮＣ ｓ — ｕ
农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用
农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用作者：匡政成等来源：《湖南农业科学》2014年第04期摘要：为了研究农杆菌和质粒DNA两种子房注射法对普通棉花品种的转化效率，以8891棉花为材料，分别在三亚和常德两地进行了转化试验。
结果表明：与质粒DNA注射相比，三亚地区农杆菌注射的转化效率高1.25个百分点；但农杆菌子房注射的落铃率高，获得的种子相对较少；而在不同的地点试验，常德地区的落铃率显著高于三亚地区；而质粒DNA直接注射的成铃率更高，虽然转化率相对较低，但也能获得有效的转化植株。
关键词：农杆菌子房注射；质粒DNA子房注射；棉花；遗传转化中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）04-0031-03Abstract： In order to study the transformation efficiency of two ovary injection methods （with Agrobacterium tumefaciens or with plasmid DNA） to normal cotton variety 8891， the transformation experiments were conducted in Sanya and Changde， respectively. The results showed that the ovary injection with Agrobacterium tumefaciens in Sanya increased the transformation efficiency by 1.25 percentage points， but it had relatively higher boll shedding rate which causing relatively less seeds， moreover， the boll shedding rate in Changde was significantly higher than that in Sanya； ovary injection with plasmid DNA had relatively higher boll setting rate， and it can obtain the effective transformation plant although the transformation efficiency was relatively lower.Key words： ovary injection with Agrobacterium tumefaciens； ovary injection with plasmid DNA； cotton； genetic transformation转基因抗虫棉是目前转基因成功并广泛推广种植的作物之一[1]，其种植面积已占我国棉花总种植面积的70%，超过了200万hm2。
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目录摘要 (4)1 前言 (4)1.1植物转基因的意义 (4)1.2棉花转基因常用的方法 ............................. 错误！未定义书签。
1.2.1基因枪法 (5)1.2.2 PEG法 (5)1.2.3显微注射法、电击法及激光法 (5)1.2.4花粉管通道法 (6)1.2.5农杆菌介导法 (6)1.3植物耐盐相关的SOS2 基因 (9)1.3.1SOS2 基因的定位克隆 (9)1.3.2SOS2 编码一个假定的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶错误！未定义书签。
1.4农杆菌介导棉花的作用 (10)2 供试材料 ............................................................. 错误！未定义书签。
2.1棉花的胚性愈伤 ......................................... 错误！未定义书签。
2.2介导菌种 ..................................................... 错误！未定义书签。
3 方法与结果 ......................................................... 错误！未定义书签。
3.1实验方法 ..................................................... 错误！未定义书签。
3.1.1平板划线 ............................................ 错误！未定义书签。
3.1.2菌落PCR鉴定................................... 错误！未定义书签。
3.1.3小摇 .................................................... 错误！未定义书签。
3.1.4大摇 .................................................... 错误！未定义书签。
3.1.5集菌 (12)3.1.6重悬 .................................................... 错误！未定义书签。
3.1.7农杆菌侵染与共培养 ........................ 错误！未定义书签。
3.1.8抗性愈伤筛选 .................................... 错误！未定义书签。
3.2抗性愈伤组织的鉴定（结果） ................. 错误！未定义书签。
3.2.1愈伤组织DNA的提取 (14)3.2.2扩PCR与电泳分析........................... 错误！未定义书签。
4 农杆菌介导的讨论 (15)4.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理 (15)4.2农杆菌菌株和质粒要求 ............................. 错误！未定义书签。
4.3 Ti载体容量 (16)5 结束语 (16)参考文献 (17)Abstract (19)致谢信 (20)农杆菌介导棉花转基因的方法左耳东（河南大学民生学院2008级生物技术专业开封475004）摘要：SOS2 基因编码一个446氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
研究发现，拟南芥受盐胁迫时，质膜上钠氢转运蛋白SCaBP8蛋白的活性增强，受了SOS2磷酸化的调节，增加植株耐盐性。
本文通过GV3101农杆菌介导的转化方法，将SOS2基因转入棉花茎尖愈伤组织，繁育成苗，获得转基因棉花，以期熟练掌握农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织的方法。
结果显示，通过农杆菌介导得到的抗性愈伤组织，经过提取DNA、PCR扩增、电泳分析，确定得到具有耐盐性基因的棉花愈伤组织，成功运用了农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织。
关键词：棉花转基因农杆菌介导转化愈伤组织SOS2基因1前言1.1植物转基因的意义自从1984年首次获得转基因烟草[1]以来, 植物转基因技术日益得到广泛的应用, 它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
在基础研究上, 对于植物基因的表达与调控、分子元件的鉴定与利用[2]等, 植物基因转化技术无疑是一个有利的研究工具在改良农艺性状上, 它可以大大缩短育种年限, 加快育种进程[3,4];更为重要的是,植物基因转化打破了物种间基因交流的界限, 目的基因的来源极为广泛, 不仅可以来自不同的植物物种, 还可以来自动物、微生物包括真菌等等。
多年以来, 人们一直利用它来改良植物的农艺性状, 如使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆性以及提高产量、改善品质等等。
此外, 还有人利用转基因技术来创造雄性不育系[5]、生物反应器[4]等。
1.2棉花转基因常用的方法1.2.1基因枪法基因枪法，是1987 年由美国康奈尔大学的Sanford 提出的一种直接基因导入法,这种方法是借高速运动的金属粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞,然后通过组织培养再生出完整植株。
由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程,因此它具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点[6]。
但是基因枪法也有自身的缺点:转化效率不高,大多在0. 1～1. 0 %的范围内,难以选择;外源基因序列常是多拷贝插入,从而导致基因沉默;转入的基因有时是呈非孟德尔遗传; 费用较高等[7]。
1.2.2PEG法PEG法是一种通过化学物质PEG(聚乙二醇) 处理去壁的原生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化。
Krens等首次通过此法在烟草中获得成功。
但是此法具有明显的缺点:原生质体培养再生难度较大;受基因型限制;原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白化苗;转化率低[7 ] 。
1.2.3显微注射法、电击法及激光法显微注射法(microinjection) 是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中,通过组织培养最终获得转化植株。
此项技术起初主要应用于动物,八十年代中期开始应用于植物的遗传转化。
虽然该法具有DNA 注射的准确性、预见性、克服远源杂交的困难等优点,但其又有工作效率低、表达不稳定等缺点,故其应用受到了限制。
电击法(elect roporation) 是八十年代初发展起来的一种转化技术,首先在原生质体上运用此法将CAT 基因(氯霉素乙酰转移酶基因)转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达[8]。
此法的主要原理是在高压脉冲条件下,细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔,为外源物质提供了通道,借此导入DNA 等遗传物质,达到转化的目的。
激光法同电击法类似,一定波长的激光聚焦后直径达0. 3～0. 5 微米时,高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔,短时间内又可自动修复。
激光法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物,转化受体材料广泛。
1.2.4花粉管通道法花粉管通道法(pollen - tube pathway) 又称子房注射法(overy injection) ,是将外源DNA 注入到子房中轴的胎座位置,经形成的花粉管胚囊,转化受精卵或胚细胞。
这是一种在整体植株水平上的转化方法,可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上进行,免除了细胞和组织培养程序,并可直接获得转化的种子,开创了整株活体基因转化的新途径。
不过这种方法看似简单但操作要求极为严格[9]。
1.2.5农杆菌介导法农杆菌是一种革兰氏染色阴性菌,普遍存在于双子叶植物中。
农杆菌属共分为四个种,即根癌农杆菌、毛根农杆菌、放射性农杆菌、和旋钩子农杆菌。
目前研究较多的是根癌农杆菌(agrobac2terium tumefaciens AT) 和毛根农杆菌( agrobac2terium rhizogenes AR) ,它们都可以浸染植物细胞,但引起不同的病症,根癌农杆菌常引起植物近地面的根茎交界处形成帽状的肿瘤。
科学家们经过长期的研究发现,农杆菌中存在一种环状的、大小约150 ～200kb 的质粒( tumor2inducing plas2mid ,简称为Ti 质粒) ,植物肿瘤即是有Ti 质粒上的一段DNA 引起的,它通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并表达,从而引起肿瘤的发生,这段DNA 称为T - DNA(t ransferredDNA)，是一种天然存在的遗传转化体系。
人们利用这种遗传转化体系将外源基因导入植物细胞,并利用植物细胞的全能性,通过组织培养,由一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株,此即农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium2medi2ated t ransfermation)[9] 。
农杆菌Ti 质粒的T -DNA 中带有Onc基因(致癌基因) ,它在植物细胞内编码植物生长素和细胞分裂素,使受浸染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。
此外T - DNA还编码Opine 类化合物,作为农杆菌代谢的氮源和碳源。
Ti 上的T2DNA 是由两端两个不完整的25 个碱基对的顺向重复序列所界定,由于T -DNA 不含编码促使自身转移物质的基因,故可将其上的Onc基因及其它不必要的序列去掉,而插入要转化的目的基因序列,从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的[9]。
自1983 年利用农杆菌转化获得首例转基因烟草以来,农杆菌介导的基因转化重要环节已形成了相当成熟的实验流程,在油料、糖料、纤维、花卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获得了转基因植株。
据统计至今获得的转基因植株中80 %以上是农杆菌介导转化法获得的[8] 。
农杆菌转化的具体操作方法也多种多样,如直接感染植物伤口法、叶盘法、原生质体共培养法、真空容器中浸染完整植株[10]、愈伤组织共培养等。
由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主,农杆菌介导的遗传转化在水稻、小麦、玉米等主要农作物上的应用一度曾非常缓慢,但自1994 年首先在水稻上取得了重要突破以来[11],在小麦、玉米等粮食作物中相继取得了成功,显示了利用此法改良主要农作物品种的巨大潜力。
农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点:操作简便不需特殊仪器,培养周期短;技术最成熟,转化效率高;外源基因多以单拷贝插入,稳定性好;可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达;较少出现基因沉默现象[9 ,12 ];可将较大片段DNA 完整地转移到植物基因组中等[10 ,13]。
不过由于T - DNA 可以在植物染色体的任何区域内插入,就有可能导致有益基因的插入失活,因此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[12]。