高效毛细管电泳实验
第五章 高效毛细管电泳和电动色谱
1.40 1.60 1.80 2.00 t/min 2.20 2.40 2.60 2.80
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3Leabharlann 101三、毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳 CGE）：按照试样中各个组 分相对分子质量的大小进行分离的方法。 用途：常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核 酸、DNA片段的分离和测序及聚合酶链反应产 物的分析。CGE能达到CE中最高的柱效。
• 毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之 间等电点的差异进行分离的电泳技术。 • 毛细管等电聚焦最具特色的应用是测定蛋白 质的等电点。在异构酶鉴定、单克隆抗体、 多克隆抗体、血红蛋白亚基等研究中，经常 用毛细管等电聚焦。
五、亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是利用配体与受体之间存在特异性 相互作用，可以形成具有不同荷-质比的配合物而达 到分离目的。
梯度升压方式对毛细管电泳分离的影响 A. 2kV至25kV，0min，一步升压；B.2kV至25kV，5min，线性梯度 升压. 样品：β-乳球蛋白A，溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，微白蛋白
二、毛细管及其温度控制
毛细管电泳柱作为分离分析的载体，其材料、 形状、内径、柱长、温度对分离度和重现性都 有影响。
缓冲液中加入添加剂，并让缓冲液与毛 细管充分平衡.如加入阳离子表面活性剂 十四烷基三甲基溴化铵(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)， 能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向. 添加剂还有聚乙烯亚胺、甲基纤维素 (MC)、十六烷基溴化铵(CTAB)等。
高效毛细管电泳电导法分离检测水中阳离子
1引言
钾、钙、钠、镁是人体中重要的无机阳离子，其中钾和钠可以调节人体内细胞的渗透压和体液的酸碱平衡，与神经调节有密切关联[1,2]。钙是骨骼发育的基本原料，在人体内调节酶的活性，参与神经、肌肉的活动和神经递质的释放[3]。镁在人体内作为酶的激活剂，促进骨的形成以及具有调节神经肌肉的兴奋性的作用[4]。饮用水中这些离子含量的高低会对人体产生一定的影响，因此，用简单、准确的方法测定这些离子的含量具有十分实际的意义。
（4）测量：用标准加入法吸取100μL K+离子标准液于进样瓶中，按（2）和（3）的操作步骤，记录K+的电泳峰高；重复步骤（4），分别重新取样与依次加入其他离子标准溶液记录4种离子的峰高。
3结论和讨论
3.1结论
将原水样的毛细管电泳谱图与加入某种离子单一标准溶液后的毛细管电泳谱图进行对比，在4个峰中出现明显增大的峰对应的加入离子的峰。由此可判断从左到右的4个峰对应的离子分别是K+、Na+、Ca2+、Mg2+。
电渗流减少将使样品在毛细管中停留时间变长，有利于组分分离，提高分析效率。
3.2.2四乙烯五胺起何作用，本实验为何没有水峰出现
石英毛细管中电渗流方向为从正极指向负极，与阴离子的电泳方向相反，会导致阴离子迁移时间较长或者不能被检测，因此需要加入阴离子表面活性剂四乙烯五胺来抑制电渗流。
水的迁移方向与电渗流方向相同，与阴离子迁移方向相反。当出现水峰时说明电渗流已到达检测器。而在本实验中，阳离子的迁移速率比电渗流快，检测器先检测到4种离子的峰，此时，电泳停止，因此检测不到水峰。
图1中大逸仙泉水样的HPCE-C4D谱图
图2添加K+单一标准溶液后的HPCE-C4D谱图
毛细管电泳
• 从二十世纪八十年代初开始，Jorgenson 等使用更细的毛细管及内径为75μm的熔 融石英管做CZE，在30kV电压下每米毛 细管的效率高达4×105的理论塔板数， 这一开创性的成果成为毛细管电泳发展
3．应用领域的不断扩展
• 与传统电泳一样，CE的主要应用领域是生命科 学，分离对象涉及氨基酸，多肽，蛋白质，核 酸等生物分子，对蛋白质结构分析具有重要意 义的肽图，对人体基因工程具有决定性作用的 DNA测序等许多当代生命科学中分离分析难题， CE都已涉及。
• 在应用于生命科学的同时，CE近年来已迅速扩 展到其它领域，包括食品化学，药物化学，环 境化学，毒物学，医学和法医学等，特别是在 手性分子和生物大分子的分离方面，CE具有独 特的优势。
以电场力驱动产生的EOF，与HPLC 中靠外部泵压产生的液流不同。EOF 的流型属扁平流型或称“塞流”。扁 平型的塞子流不会引起样品区带的增 宽，是毛细管电泳高效的重要原因 。
HPLC的流型则是抛物线状的 层流，它在壁上的速度为零，中心 速度为平均速度的2倍。
Van Deemter方程：
HAB/u Cu
• 目前，CE的研究热点包括：DNA的高速 测序，蛋白质的高效分离，糖类分析， 细胞分析，手性拆分等等。此外，毛细 管电泳还可用于物理化学常数的测定， 生产工程控制等。
历史的简单回顾
• 瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出电泳，创 造了Tiselius电泳仪，并建立了移动界面电泳方 法。1948年他获得了诺贝尔化学奖。
高效毛细管电泳实验
高效毛细管电泳实验一、实验目的1. 进一步理解毛细管电泳的基本原理；2. 熟悉毛细管电泳仪器的构成；3. 了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。
二、实验原理1．电泳淌度毛细管电泳（CE ）是以电渗流 (EOF)为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。
离子在自由溶液中的迁移速率可以表示为：ν = μE （1）r 6q πημ= （2）式中ν是离子迁移速率，μ为电泳淌度，E 为电场强度。
η为介质粘度，r 为离子的流体动力学半径，q 为荷电量。
因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比。
2．电渗流和电渗淌度电渗流（EOF ）指毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。
在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。
就石英毛细管而言，表面的硅羟基在pH 大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。
为了达到电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成所谓双电层，如图1所示。
这样，双电层与管壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta 电势。
但毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层的阳离子被吸引而向负极移动。
由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了电渗流。
电渗流的大小可用速率和淌度来表示：()E EOF ηεξν/=（3） 或者 ηεξμ/=EOF （4）式中νEOF 为电渗流速率，μEOF 为电渗淌度，ξ为Zeta 电势，ε为介电常数。
3．毛细管电泳的分离模式CE 有6种常用的分离模式，其中毛细管区带电泳（CZE ）、胶束电动毛细管色谱（MEKC ）和毛细管电色谱（CEC ）最为常用。
本实验的内容为CZE 。
4．毛细管电泳的基本参数CE 中的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（ν）则是迁移距离（l ，即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t ）之比：t l=ν （5）因为电场强度等于施加电压(V)与毛细管长度(L)之比：L VE = （6）就CE 的最简单的模式—毛细管区带电泳（CZE ）而言，结合式（1），可得：tV lL tE l a ==μ （7）在毛细管区带电泳(CZE ）条件下测得的淌度是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，我们称之为表观淌度μa ，即：EOF e a μμμ+= （8）实验中可以采用一种中性化合物，如二甲亚砜或丙酮等，来单独测定电渗流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法(简称CE)是一种应用电泳原理的分离技术,适用于分离和测定小分子有机化合物和生物大分子,如氨基酸,肽,核酸和蛋白质等,因其操作简便,分离速度快,分辨率高,样品耗费小等优点而广泛应用于分析技术领域.
其原理主要是利用电荷作用力和电流作用力共同作用于被分离物质,在快速流动的毛细管内进行分离,不同的物质根据其理化性质差异,在电场力的作用下,快速分离并达到最终的分析结果.
具体分离过程可分为三步:1.预处理:通过对样品进行一些必要的化学或物理处理,如蛋白的
脱盐,核酸的降解等,使之达到最佳测定条件.2.分离和检测:样品被注入高压,在毛细管内被电场引导向阳极(或阴极)并被快速分离,经过检测器检测,得出分析结果.3.定量分析:基于标准品,定量分析被分离物质的浓度.
在实际应用中,高效毛细管电泳法可通过改变分离毛细管的材料、加入胶体、调整电场强度等方式,进一步提高分离效率和分辨率,并能够与其他分析技术结合使用,如质谱法、光谱法等.
综上,高效毛细管电泳法是一种快速、高效、准确的分离技术,具有广泛的实际应用价值,在
企业管理和生物学等领域都有着广泛的应用前景.。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法原理1. 引言高效毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）是一种分离和检测样品成分的高效分析技术。
它基于电荷移动的原理，利用电场作用将带电样品分子按照电荷大小和大小排列分离。
本文将介绍高效毛细管电泳法的原理以及相关的基本概念。
2. 原理高效毛细管电泳法的分离原理主要包括电迁移、电渗流和扩散。
2.1 电迁移电迁移是指在电场作用下，带电离子向电极迁移的现象。
根据离子迁移速率的不同，可以将不同种类的离子分离开来。
在高效毛细管电泳中，利用气泡塞（例如墨水）将离子解进行填充到毛细管中，然后施加电压，使带电离子向电极移动。
2.2 电渗流电渗流是指随着离子迁移而产生的流动。
由于电场作用下毛细管内壁带有固定电荷，会在离子迁移的同时引起流体流动。
这种电渗流可加速离子的迁移速度，提高分离效率。
2.3 扩散扩散是指分子由于热运动而发生的自由扩散。
在高效毛细管电泳中，离子在电场作用下会发生迁移，而扩散则会限制离子迁移的速率。
通过控制毛细管的尺寸和填充材料，可以优化扩散效应，进一步提高分离效率。
3. 工作步骤高效毛细管电泳法的工作步骤主要包括样品进样、分离和检测。
3.1 样品进样样品进样是将待分析的样品注入到毛细管中的过程。
常用的进样方式包括静态进样和动态进样。
在静态进样中，样品通过注射器或微量移液器直接注入到毛细管中。
在动态进样中，利用高压电泵将样品以一定的流速进样到毛细管中。
3.2 分离分离是利用电场作用将样品中的成分分离开来的过程。
通过在毛细管两端施加电压，带电的离子根据电荷和大小进行迁移，从而实现分离。
根据需要可以调节电场强度、温度和 pH 等因素来优化分离效果。
3.3 检测检测是对分离后的样品进行定性和定量分析的过程。
常用的检测方法包括紫外光检测、荧光检测、电化学检测等。
通过对分离后的样品在检测器中发生的特定物理或化学反应进行检测，并根据峰面积或峰高来定量分析样品中的成分。
毛细管电泳法
胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）
• MECC是电泳技术与色谱技术的交叉，也是唯一既能 分离中性物质又能分离带电组分的电泳技术。把表 面活性剂加到缓冲液中，在表面活性剂的临界浓度 以上，单个表面活性剂之间聚集形成胶束。疏水性 一端聚在一起朝向里，带电荷的一端则朝向缓冲液
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•MECC的作用原理
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•电渗流后的迁移时间
• Tm=L·l/（ µe + µeof ）·V • （µe + µeof ）称为表观淌度µa（即在电渗流存在
下测得的淌度） • 溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称为“迁
移时间(t)”，根据上式可计算溶质的表观淌度： • µa =µe＋ µeof = L·l/t·V • 当L、l、V一定时， µa与 t 成反比 • 如用一种中性标记物（二甲亚砜等）单独测定
FE = qE
（q为离子电量）
FF= －6πηrν
（η 溶液粘度, r 离子半径, ν 离子速度）
• 达到平衡时，两种力大小相等而方向相反， 即
qE=6πηrν
（2）
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•电泳迁移原理
• 根据式（1），淌度 µe= ν/E • 根据式（2），ν/E = q/(6 πηr)
• 所以 µe= q/(6 πηr )
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•对缓冲液的要求
–强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度 –常用的缓冲液有Tris（三羟甲基氨基丙烷），
硼酸盐，磷酸盐等 • 缓冲液的pH值
–当测定多肽、蛋白质等时，由于溶质的pI值 相接近，此时调节缓冲液的pH值对分离特别 有用。在高于或低于溶质的pI值情况下操作， 可使溶质所带电荷改变，从而在EOF前或后 流出
毛细管电泳法
姚彤炜 主讲
毛细管电泳法
毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。
通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。
现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。
人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。
毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。
其中之一是仪器结构 简单（见图1）。
它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。
另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。
high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode图1 CE 仪器组成示意图毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。
粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。
即:V = Vep + Veo (1)电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。
CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。
当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。
高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。
毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。
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高效毛细管电泳实验
一、实验目的
1. 进一步理解毛细管电泳的基本原理；
2. 熟悉毛细管电泳仪器的构成；
3. 了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。
二、实验原理
1．电泳淌度
毛细管电泳（CE ）是以电渗流 (EOF)为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。
离子在自由溶液中的迁移速率可以表示为：
ν = μE （1）
r 6
q πημ= （2）
式中ν是离子迁移速率，μ为电泳淌度，E 为电场强度。
η为介质粘度，r 为离子的流体动力学半径，q 为荷电量。
因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比。
2．电渗流和电渗淌度
电渗流（EOF ）指毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。
在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。
就石英毛细管而言，表面的硅羟基在pH 大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。
为了达到电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成所谓双电层，如图1所示。
这样，双电层与管壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta 电势。
但毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层的阳离子被吸引而向负极移动。
由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了电渗流。
电渗流的大小可用速率和淌度来表示：
()E EO F ηεξν/=
（3） 或者 ηεξμ/=EO F （4）
式中νEOF 为电渗流速率，μEOF 为电渗淌度，ξ为Zeta 电势，ε为介电常数。
3．毛细管电泳的分离模式
CE 有6种常用的分离模式，其中毛细管区带电泳（CZE ）、胶束电动毛细管色谱（MEKC ）和毛细管电色谱（CEC ）最为常用。
本实验的内容为CZE 。
4．毛细管电泳的基本参数
CE 中的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（ν）则是迁移距离（l ，即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t ）之比：
t l
=ν （5）
因为电场强度等于施加电压(V)与毛细管长度(L)之比：
L V
E = （6）
就CE 的最简单的模式—毛细管区带电泳（CZE ）而言，结合式（1），可得：
tV lL tE l a ==μ （7）
在毛细管区带电泳(CZE ）条件下测得的淌度是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，我们称之为表观淌度μa ，即：
EO F e a μμμ+= （8）
实验中可以采用一种中性化合物，如二甲亚砜或丙酮等，来单独测定电渗流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。
三、仪器及试剂
HP3D 电泳仪。
5 mL 移液管2只，1mL 移液管共2支，分别标上四种标样的标签。
10 mL 容量瓶2个，滴管2支，分别标上标准、未知的标签。
塑料样品管若干个，分别用于标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、HCl 、NaOH 、二次水和废液，做好标号。
微量自动移液枪，酸度计。
标样：苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸，均溶于二次水中，浓度1.00 mg/mL ，作为标准品，混合稀释作为标样。
另有一个预先配制的未知浓度混合样品。
缓冲溶液(buffer)：10 mmol/L NaH 2PO 4-Na 2HPO 4 1:1缓冲溶液(NaH 2PO 4和Na 2HPO 4各5mMol/L)，20 mmol/L HAc-NaAc pH 为6 (HAc:NaAc 大约1:15)缓冲溶液，20 mmol/L Na 2B 4O 7缓冲溶液。
0.1mol/L NaOH 溶液，二次去离子水。
四、实验步骤
1. 仪器的预热和毛细管的冲洗：在实验教师的指导下，打开仪器和配套的工作站。
工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗新毛细管，顺序依次是：1 mol/L HCl 溶液30 min 二次水5 min ，1 mol/L NaOH 溶液30 min ，二次水5 min ，10 mmol/L NaH 2PO 4-Na 2HPO 4 1:1缓冲溶液5 min ，两次运行之间依次用0.1 mol/L NaOH 2min, 二次水2 min, 缓冲液5min 。
2. 混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制混合标样。
分别用5mL的移液管移取3mL 苯甲醇、3mL苯甲酸，用1mL的移液管移取1mL水杨酸、0.5mL对氨基水杨酸于10mL的容量瓶中，定容，得到苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸浓度分别为300μg/mL、300μg/mL、100μg/mL、50.0μg/mL的混合溶液作为混合标样。
（试思考为什么不采用浓度一样的混合溶液作为混合标样？）
3. 混合标样的测定：待毛细管冲洗完毕，取50μL混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪样品盘（Tray）中，进样压力50 mbar，进样时间5 s。
然后开始分析，电压25 kV。
4. 未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，。
5. 不同缓冲溶液下迁移时间的变化：未知浓度混合样品的测定完毕后，冲洗毛细管，顺序依次是：0.1 mol/L NaOH溶液 5 min，二次水 5 min，然后更换缓冲溶液为20 mmol/L Na2B4O7，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV。
按照前面的顺序再次冲洗毛细管，再次更换缓冲溶液为20 mmol/L HAc-NaAc pH为6，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV。
6. 完成实验以后，用0.1 mol/L NaOH冲洗毛细管10 min, 二次水冲洗5min。
7. 打印报告，清理实验台。
五、数据处理
1. 根据电泳的原理，判断两组混合标样中4个峰各自的归属(需要查找被分析物的p K a值)，找到在未知浓度混合样品中与之迁移时间一致的峰。
2. 按照已知浓度峰的积分面积之比折算未知浓度混合样品中各个组分的浓度（外标定量法）。
3. 计算各个组分的表观淌度和有效淌度，并说明哪个组分可以作为电渗流标记物。
本次CE 实验使用的毛细管总长度L＝56cm，有效长度l＝50cm。
4. 根据电泳的原理，判断在另外两种缓冲溶液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出合理分析和讨论。
六、注意事项
1. 冲洗毛细管时禁止在毛细管上加电压；不允许更改讲义上给定的工作电压，也不建议改变进样时间。
2. NaOH、HCl、二次水、样品和缓冲溶液等之间的切换是自动的，在实验过程中要随时注意是否放在Tray正确位置。
3. 冲洗毛细管对于实验结果的可靠性和重现性至关重要，务必认真完成每一次冲洗，不允许缩短冲洗时间或者不冲洗。
4. 做完实验以后一定要用水冲洗毛细管，否则可能会导致毛细管堵塞，严重影响实验结果，希望引起足够的重视。
5. 塑料样品管的里面容易产生气泡，轻敲管壁排出气泡以后方可放入样品盘(Tray)。
6. 合理分配实验时间，注意一组的四个同学之间的分工合作，每个同学均要实际操作冲洗、进样、分析全过程一次。