生物制药专业综合实验讲义

生物技术制药实验课程实习讲义人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的表达与纯化生物与制药工程学院制2016年6月2日目录第一节引言................................ 错误！未定义书签。

1.1表皮生长因子(EGF)概述 (2)1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (3)1.3 EGF的生物学效应及应用 (4)1.4 本实验课程设计的目的与内容 (5)第二节 EGF基因的合成与转化表达 (6)1.实验原理 (6)2.实验材料与方法 (7)2.1 实验材料及仪器 (7)2.1.1 试剂材料及试剂 (7)2.1.2 仪器设备 (8)2.2 实验方法 (8)2.2.1 试剂及培养基配制方法 (8)2.2.2目的基因hEGF的设计与合成 (9)2.2.4 电泳检测质粒DNA (10)2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备 (11)2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3） (12)2.2.7检测转化是否成功 (12)2.2.8双酶切并检测 (12)2.2.9 EGF基因的PCR扩增验证 (13)2.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测 (14)第三节 EGF表达蛋白的纯化与检测.............. 错误！未定义书签。

3.1 实验原理 (19)3.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法 (20)3.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性 (21)第一节引言1.1表皮生长因子(EGF)概述生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。

生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。

所研究的表皮生长因子( Epidemal growth factor，EGF)，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。

在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。

目前，表皮生长因子已得到广泛应用。

在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF，多种疾病的诱发原因很多，我们可以用EGF来进行详细的诊断。

之后致病的查出原因，给病人减少心理的压力，带来一线生机。

在经过强烈的光刺激后，尤其是激光，人们的眼部会有很大的损伤，最严重的就是眼角膜损伤，无法修复。

人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。

对于这些伤害，我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢EGF的药膏或者是化妆品，使皮肤变得如初[1]。

在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽，还没有命名。

是由Cohen在1960年，在提取神经生长因子时，意外发现除此种物质以外的一种多肽[2]。

多个科学家对其充满好奇心，在之后的十年内，Savage真正的研究清楚，命名此种多肽为表皮生长因子[3]。

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质不同的生物中，表皮生长因子的蛋白一级结构不同。

研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸，而少于80个氨基酸，与我们所熟悉的胰岛素一样，表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽，在具有生物活性[4]。

如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成[5]。

整个hEGF分子由两个结构域组成。

残基1～33，形成N一端结构域；34～53为C一端结构域；成熟hEGF 的序列位于单链多肽的C 一末端附近，由53个氨基酸残基组成，并且其C一端和N一端分别由Arg ／Asp ／Arg ／His邻接，故成熟的EGF分子，可以经专一性Arg内肽酶的作用，从前体释放[6]。

二级结构上存在着反平行β片层结构是EGF骨架的常见结构，N一端和C一端在整个三维结构中不会发生什么变动，维持此结构的是由三个二硫键[7]（由于6个半胱氨酸的存在），因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”[8]。

我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应，同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应，hEGF也会有此种现象。

hEGF-β和 hEGF-γ是hEGF的两种形式，在分子结构和同源性中相似度高，在蛋白中一级结构中即使是在C末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别，当它们作用于不同细胞中的同一个受体，在生物体中的作用是一样的[9]。

与许多古细菌中的酶一样如生活在温泉中古细菌，人体表皮生长因子在100℃煮沸达到30 min，仍然能保持结构、活性等稳定性；许多蛋白质在具有强列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽链被断掉，而表皮生长因子耐它的消化[10]。

EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸[11]会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。

多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。

1.3 EGF的生物学效应及应用细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。

自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。

EGF生物效应很多，如下所述：1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。

EGF在其中起着关键性的作用。

首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。

同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。

EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破，在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。

2.眼睛是我们重要的部分，眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜，是我们最担心的。

在现实生活中，很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之又少无法得到修复。

实验研究结果表明，适宜浓度的hEGF滴眼液，能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生，使损伤修复速度加快，从而辅助修复角膜[13]。

3. 研究表明，多数肿瘤的发生、发展，与EGF之间存在一定的关系。

细胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌变可能由于这些基因的突变细胞，使细胞生长不受控制。

肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体，多个EGF的表达之后与受体结合，使细胞不停的生长，这样，与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加[14]。

4.是药三分毒，我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。

实验表明：在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合，可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达，从而促进溃疡愈合[15]。

1.4 本实验课程设计的目的与内容1.实验课程设计目的：本实验课程设计重在学生自己动手设计实验，老师起辅助指导作用，旨在训练学生对专业综合知识的运用。

学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案，主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用，以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。

2.实验课程设计内容：以表皮生长因子（EGF）为例，让学生从基因的设计入手，合成出完整的EGF基因，然后表达并纯化出该EGF蛋白。

主要内容简述如下：（1）通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因，并设计出引物；（2）pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中，并通过双酶切和PCR挑选验证转化子；（3）诱导重组大肠杆菌表达hEGF 蛋白；（4）经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测（5）采用镍柱纯化，进而获取hEGF 蛋白纯品。

第二节 EGF基因的合成与转化表达1.实验原理人源表皮生长因子（hEGF）来源大致有三个方向：一是来源于人体代谢物的提取；二是来源于化学合成；三是来源于基因工程生产技术，这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。

前两种方式得到的产品都只有很低的纯度，并不能在实际应用中发挥很大的价值。

目前已知的研究中，hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。

以pET 等衍生质粒为载体、以BL21(DE3)为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一, 它采用T7 强启动子, 在IPTG 诱导下, 启动外源基因的高转录。

pET载体有pET32a（±）和pET28a（±）等系列。

下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。

图1 PET28a质粒载体2.实验材料与方法2.1 实验材料及仪器2.1.1 试剂材料及试剂琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1 mol/L NaOH溶液、双蒸水、10 mg/mlKana母液、PET-28a菌种、E.coli DE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒（离心柱型）、Goldview、BIOWEST AGAROSE、loading buffer（6×）、Hind Ⅲ DNA Marker、TAE电泳缓冲液（1×）、0.1 mol/L CaCl2溶液、Zde I酶(10U/μl)及其10× Buffer、Xhol酶(10U/μl)及其Buffer D 10×、GenClean 柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5 U/µlTaqDNA聚合酶、PCR缓冲液（10×，含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1 mol/l 的异丙基硫代半乳糖苷（TPTG）、PBS（1×）、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒：30% Acr-Bis（29:1）、1.5 M Tris-Hcl，pH 8.8、10% SDS、10% 过硫酸铵(AP)溶液、TEMED、1 M Tris-Hcl，pH6 .8；2×上样缓冲液、1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液Ⅰ（45% 甲醇：10% 乙酸：45% 蒸馏水）、脱色液Ⅱ（5% 甲醇：7% 乙酸：88% 蒸馏水），双蒸水2.1.2 仪器设备试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10 ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250 ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2 mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5 ml 微量离心管、搪瓷盘2.2 实验方法2.2.1 试剂及培养基配制方法1. 卡那霉素母液（10 mg/mL）的配制：称取10 mg卡那霉素溶解于1ml无菌水中，然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf 小管中。