大型大量质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://
PhasePrep EndoFree Maxi Kit
大型/大量质粒提取试剂盒
目录号：PL1401
适用范围：
适用于大量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备
试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成保存20次（PL1401）
RNaseA（10mg/ml）-20℃ 1.3ml
溶液P1 4℃130ml
溶液P2 室温100 ml
溶液PⅢ室温110 ml
杂质清除剂A 室温 3 ml
杂质清除剂B 室温30 ml
内毒素清除剂-20℃10 ml
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
储存事项:
1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg /ml）
置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃!
3.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热
几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时
盖紧盖子。
产品介绍：
本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。
纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。
纯化后期过程均在1.5ml 小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。
本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。
可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达5μg/μl。
超螺旋比例可高达95%，无内毒素，转染效果好。
产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便、从150-200
ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-2mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。
2.获得的质粒产量高，超螺旋比例可高达95%，浓度可达5μg/μl，纯度好，可直接
用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
3.内毒素含量极低（< 0.1EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。
注意事项
1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝
质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对
DNA的损坏。
3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。
如未见沉淀，担心DNA丢失，
可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。
4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260
值为1相当于大约50μg/ml DNA。
电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。
本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。
5.质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以
知道。
处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确切大小。
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
⇨提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。
1.取过夜培养菌150 ml左右菌液（最大不超过180ml-200ml），装入合适的离心瓶
中，10,000 x g于4℃离心2 min沉淀菌体，完全弃除上清。
2.加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。
细菌悬液移入50 ml离心管中，室温放置3~5 min。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置4-5 min，使细菌完全裂解，
溶液透明。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。
此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.加5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。
上述
裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml 离心管中。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
5.加入10 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。
注意：使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。
如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
6.于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干
残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。
注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但
是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。
7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽
然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。
然后将质粒溶液转入2个新的1.5 ml离心管中（每个700μl）。
可选步骤（一般不需要）：如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15 min消化RNA。
8.每管加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的
内毒素清除剂，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=5分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。
注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μl杂质清除液A，充分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。
9.42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。
10.室温14,000 x g离心5 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须
至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上）。
上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。
将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。
11.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μl），轻柔混匀，4℃
14,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。
12.每个离心管加适量TE或者纯水（100~200μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以
辅助溶解）。
要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。
最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA（高达5-10μg/μl）。
如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。
高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://HighPure Plasmid Maxi Kit高纯度质粒大量快速提取试剂盒目录号：PL12试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次(PL1201)RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl溶液P1 4℃77 ml溶液P2 室温77 ml溶液N3 室温77 ml去蛋白液PE 室温63 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液WB 室温25 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。
有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便，从150-300ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80 %左右。
质粒提取试剂盒说明书
质粒抽提：质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
实验原理：提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
详细内容请参考《分子克隆实验指南》。
另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。
碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。
煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。
加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。
但是。
闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。
当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
nucleobond质粒大抽提中文说明书
nucleobond质粒大抽提中文说明书1.取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。
再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。
建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。
时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。
直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。
如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。
对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。
过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2.每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。
确保沉淀*散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNaseA。
最高速度vortex10-20秒或更长时间，悬起沉淀。
一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。
如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。
3.每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。
颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。
如果加入溶液I后细菌没有*散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。
遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4.每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5.12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。
QIAGEN质粒大提试剂盒
产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。
注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。
2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
3.使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
7.实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
8.用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
操作步骤：1.柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
质粒大提试剂盒说明书
北京索莱宝科技有限公司质粒大提试剂盒说明书货号：D1110规格：10次保存：常温保存，复检期一年。
试剂盒内容：RNaseA(10mg/ml)1ml溶液Ⅰ60ml溶液Ⅱ60ml溶液Ⅲ80ml漂洗液2×15ml洗脱液30ml吸附柱10个收集管(50ml)20个说明书1份产品说明：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，一般从50-100ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达85-90%。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤:第1页共3页1.收集50-100ml过夜培养的菌液11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3.向离心管中加入5ml溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过5分钟，以免质粒受到破坏。
4.向离心管中加入7ml溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多，可在此步放置5分钟，以尽可能的降解RNA)。
11000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书预期用途
本试剂盒可用于提取咽拭子样本中人上皮细胞、细菌和真菌的DNA。
本试剂盒提供的裂解液能快速有效裂解细胞，裂解产物能够直接用于PCR 扩增，并且灵敏度高，特异性强，省去了繁琐的核酸提取与纯化步骤，实现快速PCR检测。
对于病原微生物检测，流行病学调查、菌群调查及其它一些以口腔微生物为样本的核酸检测都非常适用。
操作步骤
1、待检拭子样本直接置于200IFatlyeL1中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管壁挤压数次后弃拭子；
2、吹打混匀，95℃孵育5min；
3、孵育后的样本12，000rpm离心2，3min，上清可直接用于PCR扩增，上清如不立即使用，需置于-20℃长期保存。
推荐使用咽拭子DNA快速提取扩增试剂盒（荧光PCR法），货号MKNJGNSWDLAQP008。
注意：
离心后的上清加入PCR反应体系的量不宜超过总体积的5%。
如偏好较小体积的反应体系，可将裂解产物稀释5倍或10倍后用作模板；
样本要求
用专用采样拭子，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
以上标本可立即用于测试，也可放置在-20℃条件下长期保存。
注意事项
2、如样本中扩增反应抑制物较多时，可将裂解后的上清稀释5倍作为模板，进行PCR扩增。
3、实验完毕用1%的次氯酸钠或75%酒精处理工作台和移液器。
introvigen试剂盒质粒大提操作步骤K2100-16
PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification KitsFor Mini, Midi, and Maxi preparation of Plasmid DNA Catalog numbers K2100-14, K2100-15, K2100-16, K2100-17, K2100-26, and K2100-27在开始之前作如下准备按照说明把RNase A加到Resuspension Buffer (R3) 中。
如果需要，把Lysis Buffer (L7) 放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
大量质粒提取过程注意事项对于所有的步骤，包括使用试管架或者核酸纯化架。
在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100-200ml （高复制数的质粒）或者250-500ml（低复制数的质粒）过夜培养。
分离大质量质粒DNA1平衡：把30ml的Equilibration Buffer (EQ1) 直接加入到过滤筒中，过滤筒插到PureLink® 高纯的大等管中，让溶液在管中靠重力流下。
2收集：收集过夜的LB培养基到一次性50ml，4000g，10分钟离心，去除培养基。
3重悬：加10ml的含有RNase A的Resuspension Buffer (R3)到细胞沉淀中，轻柔的重悬细胞沉淀到成为均质的细胞悬液。
4溶解：加入10ml Lysis Buffer (L7) 。
轻柔的反向混合盖盖子的管子直到形成均质的溶液。
不要涡旋。
室温下孵育5分钟。
5沉淀：加10ml Precipitation Buffer (N3)。
立刻轻柔的反向混合盖盖子的管子直到形成均质的溶液。
不要涡旋。
6过滤：把沉淀溶菌产物转移到管中，让其按重力流下。
可选择：用10ml的Wash Buffer (W8) 洗管子，让缓冲液顺重力流过管子。
7清洗：弃去内部的过滤筒。
加入50mlWash Buffer (W8) 洗管子，弃去从管子里流下的Wash Buffer (W8)溢出液。
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤AxyPrep Maxi Plasmid Kit (AXYGEN) AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作说明实验准备:, 检查Buffer S1中是否已加入RNaseA。
, 检查Buffer W2中是否已加入无水乙醇。
, 检查Buffer S2是否出现沉淀，如有沉淀，在37?水浴中溶解沉淀，再平衡至室温。
,注意,Buffer S2不用时请立即盖紧，防止被空气中的CO中和。
, 2, 将Buffer S1，Buffer S3K和Buffer B放置4?预冷。
, 将洗脱液Eluent放置65?水浴中预热。
实验步骤:1. 将待提取的质粒对应菌液在5mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
2. 次日，将5mL培养后的菌液接种至200mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
3. 将菌液分装至5个50mL离心管中，每管40mL，4? 3000×g离心5min，彻底弃净上清。
4. 加入Buffer S1(已加RNaseA，4?预冷)，每管4mL，共20mL，涡旋充分重悬菌体。
5. 加入Buffer S2，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
6. 加入Buffer S3K(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
7. 加入Buffer B(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀。
8. 4?10000×g离心10min，小心取上清至新管，最终合并为2管。
9. (可选步骤)再次4? 10000×g离心10min，小心取上清至新管。
10. 将上步收集的上清全部加入Maxiprep syringe filter中，将注射器芯从上方推入，下方用纯化柱(Maxiprep column)盛接滤液。
11. 推注注射器芯，将液体滤至纯化柱中，同时在纯化柱下方连接输液器(预先剪除输液针)，并用10mL注射器负压反复抽吸，直至液体滤尽。
质粒大提操作
质粒大提操作手册（Qiagen试剂盒，无内毒素装）操作流程图准备工作检查试剂盒。
联系高速离心机。
准备50 ml（或更大）圆底离心管，灭菌备用。
准备试管架，实验前操作台上紫外线照射备用。
无菌离心管若干。
移液器与无菌吸头若干。
试剂准备：P3缓冲液4℃预冷异丙醇无水乙醇实验前取冰备用。
细菌培养：不要超过所推荐的最大，最好使用LB培养基，培养12-16小时，使每毫升细胞数达到3-4×109。
操作过程使用前准备工作QIAGEN-tips使用中需要保持直立。
LyseBlue的使用：LyseBlue和P1缓冲液以1：1000（10μl：10 ml）混合形成悬液，配制时要用力振荡充分混匀，加入P2后可形成蓝色溶液，加入P3后溶液变为无色。
将RNase A全部加入到P1缓冲液，使其浓度达到100 μg/ml。
将40 ml 96-100%乙醇加入到无内毒素水中，配制成70%无内毒素乙醇。
操作过程1、从平板上挑一个克隆到2~5 ml的抗性培养基中（一般是100 μg/ml的Amp），37 °C，300 rpm振荡培养8 hr。
2、如果是高拷贝质粒，取100 μl培养菌液加到100 ml抗性培养基中。
如果是低拷贝质粒，则取250 μl培养菌液到250 ml抗性培养基中，37 °C，300 rpm振荡培养12~16 hr。
3、6000 g，4°C离心15 min收获菌体细胞。
所得细胞可保存于-20℃备用。
4、加入10 ml的buffer P1（使用前可加入10 μl LyseBlue充分混匀）悬浮菌体细胞，充分混匀，可涡悬振荡，或者用吸头吹吸均匀。
5、加入10 ml的buffer P2，盖上离心管盖，上下用力翻转4~6次，以充分混匀溶液。
室温下放置5 min。
请勿涡旋振荡，裂解反应请勿超过5 min。
准备QIAfilter Cartridge：将盖子放置于QIAfilter Maxi Cartridge流出口上。